[发明专利]慢病毒载体冻干保存方法及制剂

说明书

本发明涉及慢病毒载体新型冻干保存方法及制剂。本发明揭示了一种新的制备慢病毒载体(颗粒)冻干制剂的方法，本发明的方法制备的慢病毒载体冻干制剂，不管在室温还是低温条件下均能够长时间地保持高的病毒滴度。本发明还提供了适用于这一方法的冻干保护剂，其能良好地保留病毒活性，并且其还具有配方简易、制备方便的特点。

技术领域

本发明属于病毒学以及生物制剂保存领域；更具体地，本发明涉及慢病毒载体新型冻干保存方法及制剂。

背景技术

癌症免疫疗法和单基因疾病的治疗方式的开发使人们对慢病毒载体的使用越来越感兴趣。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染免疫细胞、神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。在目前新型的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)或者嵌合抗原受体NK细胞免疫疗法(CAR-NK)领域内有着很广泛的应用，是携带CAR基因整合至T/NK细胞的常用方式。另外，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

慢病毒目前还没有形成稳定的产品，主要的原因是从上游生产到下游纯化和制剂配方还没有形成成熟的工艺过程。而对于其制剂配方和冻干工艺的研究内容更是少之又少，这一部分的研究的重要性往往被人们所忽视。

慢病毒载体的长期储存是本领域的难题，其要求非常低的温度如-80℃，而在-20℃保存则不能超过一周。用于临床基因治疗和细胞免疫治疗方案的慢病毒载体目前存在着比疫苗更加严重的低温保存和冷链运输的问题，已经配制成液体的慢病毒载体需要储存在≤-65℃并在冷冻状态下运输，这要求更加严格的运输和储存条件，如此低温条件极大地增加了其存储和运输成本，也为慢病毒的质量保证带来了安全隐患。目前往往采用干冰来运输。并且，病毒的反复冻融也会极大地降低病毒滴度。

本领域中，目前对于慢病毒载体的制剂及冻干工艺开发还未见文献研究结果和专利公开，其原因一方面可能在于整个慢病毒的产业化目前处于起步阶段，慢病毒的上游工艺目前还处于起步阶段，下游工艺更是得不到发展；另一方面，慢病毒载体制剂和冻干工艺的研究和开发还存在着技术障碍。

因此，开发慢病毒载体的冻干稳定保存工艺成为了整个基因治疗和细胞免疫治疗亟需解决的问题。获得配方简易、制备方便、稳定的冻干保护剂对慢病毒的广泛应用显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供慢病毒载体新型冻干保存方法及制剂。

在本发明的第一方面，提供一种制备慢病毒载体(颗粒)冻干制剂的方法，包括：将慢病毒载体与冻干保护剂混合，冷冻干燥；其中，所述的冻干保护剂包括：海藻糖：5～30％(w/w)；二价阳离子：0.1～80mM；和氨基酸：0.02～5％(w/w)。

在一个优选例中，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁶，较佳地高于5×10⁶，更佳地高于1×10⁷，如高于2×10⁷或3×10⁷。

在另一优选例中，所述的慢病毒载体的滴度在1×10⁶～1×10⁹。

在另一优选例中，所述的冻干保护剂包括：海藻糖：10～20％(w/w)；二价阳离子：0.5～20mM；和氨基酸：0.05～3％(w/w)。