[发明专利]一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法

说明书

本发明涉及一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法。在本发明中，羊抗鼠IgG标记的铕（III）纳米粒子偶联物作为一种通用的平台，可以介导多重抗体的标记，提高标记特异性和效率。以AHD、AOZ、SEM和AMOZ为例，本发明涉及一种同时检测四种呋喃代谢物的多重荧光试纸条检测方法，并将这种纸传感器的应用于鱼肉样品的检测。结果表明在10分钟内同时对其进行肉眼检测，其消线值分别为0.1，0.5，0.5和0.5ng/g。简而言之，本发明中开发的这种免疫测定方法是检测饲料或食品动物样品中硝基呋喃代谢物的有效工具。

技术领域

本发明涉及了一种纳米粒子标记免疫层析法检测4种硝基呋喃代谢物的技术，总体属于农业领域畜牧与水产业，具体属于动物源性产品安全检测兽药残留检测领域。

背景技术

硝基呋喃是一种合成的广谱抗生素，广泛用于医疗和兽医行业，用于治疗胃肠道感染，预防病原微生物感染。硝基呋喃对多种生物具有杀菌作用，并具有低毒性。但是，硝基呋喃的滥用会导致耐药菌株的出现。此外，动物实验表明，硝基呋喃具有一定的致癌性，致突变性和环境毒性。为确保人类食品安全，自1995年以来，欧盟已禁止将硝基呋喃用于食用动物。美国和中国也严格禁止在育种过程和饮用水中添加硝基呋喃。2003年，为这些硝基呋喃代谢物设定了1ng/g的最低要求性能限值（MRPL）。因此，必须开发有效的方法和便携式工具来监测和量化动物源性食品中硝基呋喃的代谢产物。

近几十年来，检测食品中硝基呋喃的最常用方法是液相质谱分析方法，包括液相色谱-质谱（LC-MS），超高效液相色谱-串联质谱光谱法（UPLC-MS）和超高效液相色谱法与三重四极杆串联质谱联用技术（UHPLC-QqQ-MS / MS）。这些方法虽然准确性和灵敏度很高，但是仪器价格昂贵，需要专业技术人员操作，此外，这些方法也不适用于高通量现场检测过程。而快速免疫分析技术具有灵敏度高，成本低，样本量小等优点，广泛用于小分子，核酸和蛋白质的快速检测。虽然酶联免疫吸附测定（ELISA）的灵敏度相对较高，但操作步骤复杂，需要四个独立的板来分析四种代谢物，这不适合现场快速检测和同时检测四种代谢物。基于上述缺陷，近年来在ELISA的基础上开发了一种新的高灵敏度检测方法，用于同时检测多种代谢物的免疫色谱法（ICA）。

免疫色谱分析是基于抗原-抗体反应的一种常见类型的免疫分析，并根据抗原-抗体复合物的性质和复合物形成的顺序分为两个主要类别：“夹心”和“竞争”。近年来，这些方法结合了新的纳米材料（铕（III）纳米粒子，功能金纳米粒子，碳纳米粒子，量子点纳米珠和上转换材料，磁性纳米粒子）或新技术（热对比，纳米催化剂放大，无功信号放大器，表面增强拉曼散射，等温核酸扩增）。这些方法已被广泛用于疾病筛查和诊断，被称为“试纸”，并且具有灵敏，操作简单，快速，成本低，多路复用和智能等许多优点。还有一些用于监测硝基呋喃代谢物的免疫色谱技术，然而，他们中的大多数只专注于一种硝基呋喃代谢物，很少有人追求多重免疫色谱分析。因此，仍需要开发多重免疫测定法用于食品中硝基呋喃残留物的高通量筛选。

发明内容

本发明旨在开发一种基于四种单克隆抗体（mAb）和羊抗鼠IgG的羊抗鼠二抗介导铕（III）纳米粒子标记免疫层析法（M-EICA），可以同时和特异性地鉴定样品中的四种硝基呋喃代谢物。以1-氨基-2-内酰脲(AHD)、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、氨基脲(SEM)和5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)为例，本发明主要包括单克隆抗体mAb的表征、用Eu纳米球标记AHD-mAb，AOZ-mAb，SEM-mAb和AMOZ-mAb、羊抗鼠二抗介导铕（III）纳米粒子标记免疫层析法(M-EICA)的制备。

本发明通过以下技术方法实现：

一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法，具体步骤如下：

（1）单克隆抗体mAb的表征：