[发明专利]一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法

权利要求书

1.一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法，其特征如下，具体步骤如下：

（1）单克隆抗体mAb的表征：

首先，通过用于96孔板的棋盘试验获得CPAHD-OVA和AHD-mAb的最佳工作浓度；然后，在该工作点建立2-NPAHD的竞争抑制曲线，并拟合四参数逻辑方程以获得2-NPAHD的IC₅₀；

（2）Eu纳米球抗体偶联物的制备：

首先，用50mM pH值6.0的MES缓冲液将100μL Eu纳米球稀释至1mL并超声处理；随后，将10μL 2mg/ml的NHS溶液和10μL 1mg/ml的EDC溶液加入混合物中并搅拌30分钟；接下来，将100μg羊抗鼠IgG二抗溶液和100μLCBS缓冲液加入到NHS活化溶液中，将混合物在室温下孵育2小时，并用40μL 4％BSA溶液封闭；然后，将混合物离心15分钟，将沉淀物悬浮在1mLPBST中并超声处理1分钟；最后，在室温下将50μg AHD-mAb加入溶液中孵育2小时，将混合物离心15分钟；除去上清液，将沉淀重悬于1mL硼酸缓冲液中并超声处理以备进一步使用；将AOZ-mAb，SEM-mAb和AMOZ-mAb按上述相同的程序标记；

（3）羊抗鼠二抗介导铕（III）纳米粒子免疫层析法的建立：

铕（III）纳米粒子免疫试纸条是将NC膜，样品垫和吸收垫逐层粘贴到PVC粘合剂卡上制成的；分别将CPSEM-OVA，CPAMOZ-OVA，CPAOZ-OVA，CPAHD-OVA和羊抗鼠IgG喷到NC膜上，T线1，T线2，T线3，T线4和C线彼此间隔3.8mm；然后，将组装好的卡在37℃下干燥6小时；最后，将条带卡切成3.9mm宽的条带，并在室温下储存在干燥的箱子中。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法，其特征在于，所制备的纳米粒子免疫试纸条用于现场检测时，先处理待检样品，然后将处理好的待检样品160μL和四种Eu纳米球标记抗体各10μL加入微量滴定孔中，10分钟内读取结果。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测四种硝基呋喃代谢物的免疫层析法，其特征在于，所制备的纳米粒子免疫试纸条对CPSEM、CPAMOZ、CPAHD和CPAOZ的检测限分别为0.5，0.5，0.1，0.5ng/g。