[发明专利]一种提高红曲霉菌胞外色素的方法

说明书

本发明提供了一种提高红曲胞外色素的方法，该方法是将红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上甾醇还原酶ERG4/ERG24家族蛋白的基因敲除。本发明通过农杆菌介导转化技术敲除红曲霉菌中编码ERG4/ERG24基因。本发明从植物双元质粒pCAMBIA1300载体出发，通过根癌农杆菌EHA105介导将重组质粒转化至红曲霉菌中，显著提高了胞外色素生产水平，结果表明该重组菌株具有较好的传代稳定性。液态发酵结果显示，亲本菌株胞外红曲色素为4.92U/mL，本发明构建的重组菌株胞外红曲色素达6.52U/mL，胞外色素生产量提高32.52％，说明通过本发明的方法能够显著提高红曲胞外色素的产量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高红曲霉菌胞外色素的方法。

背景技术

红曲霉菌，作为一种丝状真菌，属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、散囊菌目、红曲科。红曲色素是由红曲霉菌次级代谢产生的一系列聚酮类化合物的天然色素，在中国、韩国和日本一直被作为食品添加剂广泛应用于饮料、酱、食用油、面包、糕点等领域，已有上千年的历史。同时，由于红曲色素还具有广泛的生物活性如调节血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在医生保健产品开发和医疗领域的应用也逐渐受到重视。

目前食品中所用的红曲色素一般为混合色素，主要分为红、橙、黄三大类。由于红曲霉固液态发酵产生的红曲色素主要是胞内色素，为醇溶性色素，由红曲霉在发酵过程中直接合成，占红曲霉产生的红曲色素总量的70％～80％。而胞外色素主要为水溶性色素，是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的，占红曲霉产生的红曲色素总量的20～30％。胞内色素易溶于乙醇、丙酮等极性较大的溶剂，都是非水溶性的色素。采用乙醇、丙酮等极性比较大的溶剂对胞内色素进行浸提萃取，会造成浸提不彻底且浸提之后回收难度较大，工艺复杂且成本较高，因此在食品应用方面受到一定的限制。由此可见，提高红曲霉胞外色素的产量，将是红曲色素产业化必须解决的关键问题之一。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种提高红曲胞外色素的方法以解决现有技术中常规培养红曲霉产红曲胞外色素产量较低的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种提高红曲胞外色素的方法，该方法是红曲霉菌中编码麦角甾醇合成途径上甾醇还原酶ERG4/ERG24基因敲除，使该基因在红曲霉菌中不能正常表达；并利用植物双元质粒pCAMBIA1300载体，通过根癌农杆菌EHA105介导将重组质粒转化至红曲霉菌中，构建得到了红曲胞外色素高产菌株。

其中，所述的红曲霉菌为紫色红曲霉菌(Monascus purpureus)，所述编码ERG4/ERG24还原酶基因为Monascus_07017，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

其中，所述将紫色红曲霉菌中编码麦角甾醇还原酶ERG4/ERG24基因敲除，是利用农杆菌EHA105介导转化技术敲除紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶ERG4/ERG24基因。

其中，农杆菌EHA105介导转化技术敲除紫色红曲霉菌中编码甾醇还原酶 ERG4/ERG24基因，包括如下步骤：

作为优选，上述的通过农杆菌介导转化法基因敲除技术使编码ERG4/ERG24还原酶基因缺失，包括如下步骤：

(1)利用软件分析SEQ ID No：1所示的序列；

(2)以紫色红曲霉菌的cDNA为模板，以7017-up-osc-F(序列为SEQ ID No：2)、7017-up-osc-R(序列为SEQ ID No：3)为一对引物和7017-dn-osc-F(序列为SEQ ID No：4)、7017-dn-osc-R(序列为SEQ ID No：5)为一对引物分别进行PCR扩增得到 Monascus_07017基因的5’和3’同源臂片段；