[发明专利]一种转化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸的重组菌的构建及应用

说明书

本发明公开了一种转化L‑苏氨酸生产L‑2‑氨基丁酸的重组菌的构建及应用，属于生物工程技术领域。本发明所述的生产方法利用一种表达双质粒的重组菌，同时实现三种酶的高效表达，将L‑苏氨酸转化为L‑2‑氨基丁酸，并偶联一辅酶再生体系，通过将NAD+转化为NADH，使得NADH在体系中浓度相对稳定，转化能够高效进行。更进一步地，在此过程中由甲酸铵转化而来的CO2可溶于转化体系中生成的氨水，对环境污染小，有工业化应用价值。本方法具有转化条件温和、专一性强、成本低廉、转化时间短等优点。采用本方法制备L‑2‑氨基丁酸，投入40g/L L‑苏氨酸，所得产物L‑2‑氨基丁酸的浓度为43.3g/L，转化率达99.9％以上。

技术领域

本发明涉及一种转化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸的重组菌的构建及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用。同时2-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛用于药物的合成，如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成。

目前，L-2-氨基丁酸的合成方法包括化学法和生物法。化学法主要包括酮丁酸还原法、脱硫反应法、氨解反应法、卤代氨解法、化学拆分法等。但是此类方法反应条件苛刻、易生成副产物；成本较高，不宜进行工业生产；同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。

生物法合成L-2-氨基丁酸具有立体选择性高、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。生物法又包括微生物发酵法和细胞外酶转化法。微生物发酵法专属性较强，条件温和，环境污染少，但发酵过程会产生与目标产物结构相似的副产物，反应产物成分复杂，后续分离困难。酶催化转化则是一种高选择性反应，可达到定向转化的目的。但多酶转化工艺多面临着酶活力低、酶稳定性低、辅酶循环再生效率低、多酶添加复杂、工程放大难等问题。而重组菌全细胞参与转化能在一定程度上解决上述问题，但仍存在转化时间长、转化效果差等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服目前生产技术上的问题，提供一种高效简便、低成本、易于工业化生产的转化L-苏氨酸制备L-2-氨基丁酸的方法。

本发明首先提供了一种转化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达苏氨酸脱氨酶、甲酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶，所述双质粒表达系统包括PETDuet-1质粒和pRSFDuet-1质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述PETDuet-1质粒用于表达苏氨酸脱氨酶、甲酸脱氢酶，所述pRSFDuet-1质粒用于表达亮氨酸脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述苏氨酸脱氨酶选自大肠杆菌，优选大肠杆菌Escherichia coli W3110，基因序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶选自苏云金芽孢杆菌，优选苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis serovar kurstaki YBT-1520，基因序列为SEQ IDNO:2，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

在本发明的一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶选自假丝酵母。

在本发明的一种实施方式中，优选的，所述甲酸脱氢酶经过密码子优化后核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主优选为E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供了一种转化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸的方法，所述方法为利用上述的转化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸的重组菌将底物转化为L-2-氨基丁酸，并偶联辅酶再生体系。