[发明专利]一种恩拉霉素高产菌株及其构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种恩拉霉素高产菌株及其构建方法。本发明将传统高产菌的选育与转录组测序技术相结合，通过对比已知的两株抗性存在显著差异的菌株的基因组序列，进而找到两株菌的基因组序列之间的不同碱基并确定其所在基因组序列中的位置和它所决定的基因名称及作用，针对该基因对抗生素生产菌株进行遗传操作，从而筛选出高抗性工程菌株。获得的基因工程菌较原始菌株的恩拉霉素产量分别提高了5％，18.3％和19.5％，本发明为恩拉霉素高产菌株的选育提供了一种新思路。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种恩拉霉素高产菌株及其构建方法。

背景技术：

恩拉霉素(Enramycin)又名持久霉素，是由土壤中的放线菌发酵产生的一种非核糖体多肽(NRP)类抗生素。该抗生素对革兰氏阳性菌特别是禽畜肠道内有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用；饲料中添加适量的恩拉霉素不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。同时恩拉霉素具有广谱、低毒、无残留、不易产生耐药性和交叉抗性等优点，因此是目前少数几种可用于饲料添加剂的抗生素之一。

目前恩拉霉素的生产主要由杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)发酵获得，由于该菌株在发酵过程中普遍存在发酵周期长、产素水平低、菌株退化严重等问题，限制了恩拉霉素的大规模生产和进一步的推广应用。因此采用遗传育种技术进一步提高恩拉霉素产生菌的产素水平及生产性能，对于降低恩拉霉素生产成本、提高市场竞争力具有重要的意义。

目前针对放线菌高产菌株的选育主要采用的是遗传育种的方法，遗传育种方法主要有两种：一种为传统(物理/化学)诱变育种技术，即利用紫外诱变、化学诱变、微波诱变、太空诱变以及离子束诱变等技术对生产菌株进行诱变处理，然后通过大量筛选，获得生产性能更为优良的变异菌株。该方法在抗生素高产菌株的选育方面贡献巨大，目前已成功选育出很多优良菌种。王世梅等利用紫外线诱变选育出数株阿扎霉素(Azinomycin)B产量较出发菌株高3倍以上的高产菌株，且传代稳定；阎永贞等对一株纳他霉素产生菌(Streptomyces natalensis)SIPI-NHF09进行了紫外和微波相结合的诱变处理，并获得了一株纳他霉素高产突变株，其纳他霉素产量是出发菌株的3.5倍，且遗传性状稳定，具有一定的产业化开发价值。但是传统的诱变育种技术也存在很大缺陷，优良突变菌株的筛选往往具有很大的盲目性，筛选工作量非常大。特别是对放线菌等生长周期较长的菌种而言，筛选工作更是费时费力，短时间内往往难以达到理想效果。另外一种针对放线菌的遗传育种方法为：现代分子生物学遗传育种技术，即通过对特定基因进行遗传改造来进一步提高菌株的生产性能。该方法可直接针对影响菌株产素水平的基因进行遗传改造，目的性更强，遗传操作也很简便。然而对于大部分抗生素产生菌而言，由于其抗生素的生物合成机制及代谢调控机制非常复杂，抗生素的产生往往受多重因素调控，因此很难通过简单的遗传操作而达到理想效果。

上述遗传育种方法虽然都存在各自的优势，但是它们都有以下几个共同的缺点：1)菌体突变方向不确定；2)选育时间较长；3)只能在宏观上去判断菌体抗性的变化，对于具体是由哪些基因的改变决定了产恩拉霉素菌体的抗性强弱这一问题并没有答案。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将传统高产菌的选育与转录组测序技术相结合，通过对比已知的两株抗性存在显著差异的菌株的基因组序列，进而找到两株菌的基因组序列之间的不同碱基并确定其所在基因组序列中的位置和它所决定的基因名称及作用，针对该基因对抗生素生产菌株进行遗传操作，从而筛选出高抗性工程菌株。

本发明所提供的技术方案之一，是一种恩拉霉素高产基因工程菌，所述基因工程菌是通过在杀真菌素链霉菌宿主中过表达以下基因中的至少一种获得：

(A)基因A(hypothetical protein；dehydratase；MarR family)，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；