[发明专利]一种恩拉霉素高产菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种恩拉霉素生产基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过在杀真菌素链霉菌宿主中过表达基因B获得，所述基因B，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种恩拉霉素生产基因工程菌，其特征在于，所述杀真菌素链霉菌宿主为敲除UPP基因后的杀真菌素链霉菌（S. fungicidicus）F1。

3.权利要求1或2所述的一种恩拉霉素生产基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）构建含目的基因的接合转移质粒，所述接合转移质粒以UPP基因作为标记；

（2）将步骤（1）构建的质粒接合转移至恩拉霉素生产菌株；

（3）筛选：挑取转化子后传代，点板筛质粒丢失的菌株，并做菌落PCR验证，获取整合完成的菌株。

4.如权利要求3所述的一种恩拉霉素生产基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述接合转移质粒以pkc1139质粒为载体。

5.如权利要求3所述的一种恩拉霉素生产基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）构建含UPP基因的整合型载体

将UPP基因与pkc1139载体连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，即得含UPP基因的整合型载体pkc1139-U；

（2）构建含目的基因的接合转移质粒

以杀真菌素链霉菌（S. fungicidicus）F1基因组为模板，设计引物，克隆出含目的基因的基因片段；将两段相同的目的基因片段酶切连接后，与T载体连接，将连接成功的载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞；提质粒酶切验证后，将正确的质粒与pkc1139-U载体进行连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，提质粒酶切验证，获得含目的基因的接合转移质粒；

（3）接合转移到链霉菌

将含有目的基因的接合转移质粒转化到E.coliET12567感受态细胞中，菌落PCR验证后，挑取正确的大肠杆菌转化子与杀真菌素链霉菌做接合转移，通过接合转移的方法将质粒转移到杀真菌素链霉菌中，实现目的基因的过表达；

（4）筛选：挑取转化子在40℃条件下MS培养基上进行传代培养后，挑取在阿普拉抗性平板上不生长，在五氟尿嘧啶平板上生长的菌落进行菌落PCR验证，筛选获得成功表达目的基因的菌株。

6.权利要求1或2所述基因工程菌在生产恩拉霉素中的应用。