[发明专利]一种高效识别蛋白丝氨酸庚糖基化的多克隆抗体、制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种高效识别蛋白丝氨酸庚糖基化的多克隆抗体、制备方法及其应用，所述抗体用于检测包含不同构型丝氨酸庚糖基化修饰的天然蛋白以及新型抗生素的筛选与发现。抗体的制备过程包括：先利用Wittig反应构建出七碳糖骨架，后利用Sharpless不对称氧化反应得到6位两种绝对构型的庚糖，在硫苷和三氯亚胺酯介导的糖基化反应的帮助下，获得与生物体内糖基化修饰构型一致的丝氨酸庚糖，后利用多肽固相合成方法获得相应的糖肽，序列为：Ac‑GS(Hep)GL‑OH；将得到的半抗原偶联到载体蛋白BSA上，得到抗原，用抗原免疫动物，收集免疫新西兰兔血液制备抗血清，并通过亲和纯化得到IgG。本发明制备的抗体特异性好，效价高。

技术领域

本发明涉及医药化学技术领域，具体地说，是一种高效识别蛋白丝氨酸庚糖基化的多克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术

能够粘附宿主细胞或组织是绝大多数致病细菌实现有效侵染的先决条件。致病细菌通常会利用一类称为粘附素的蛋白特异地识别宿主细胞表面的受体从而高效粘附于细胞表面。扩散附着性大肠杆菌(Diffuse-adheringE.coli,DAEC)和产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli,ETEC)是一类引起人和幼畜腹泻的重要病原菌，他们分别编码AIDA-I和TibA两种粘附素。之前的研究表明这两种粘附素与细菌致病性直接相关，且有报道称AIDA-I和TibA均是糖蛋白，但其糖基化机理和具体功能未知。在一项最新的研究中，邵峰团队鉴定出一个新型的七碳糖转移酶(BAHT:bacterialautotransporterheptosyl-transferase)家族，催化AIDA-I和TibA的Heptose糖基化修饰，从而实现细菌对宿主细胞的粘附和在小鼠肠道中的有效定植(图1)。

BAHT家族和已知的糖基转移酶没有序列上的同源性，所以其具有独特的生化性质，但BAHT催化和底物识别机理未知。晶体结构的解析发现BAHT家族中的TibC单体分子可以分成N端β折叠桶结构域和C端催化核心结构域。12个TibC单体分子通过“手拉手”和“背靠背”两种方式聚合成一种新颖的花环状的12聚体结构；该12聚体复合物中间形成一个很大的圆柱体通道，所有单体分子的催化活性中心都面向这个通道内部，提示底物的糖基化过程可能是通过底物穿过这个通道来实现的。进一步的ADP-D,D-Heptose与TibC的复合物晶体不仅揭示了参与糖基转移的关键残基和催化机理，而且还阐明了BAHT家族不同成员对配体立体构型选择性的结构原理。首先BAHT催化的糖基化转移为构型反转反应：ADP-D,D-Heptose底物中Heptose端位糖苷键为β构型，当Heptose转移到底物后，所得到的Ser-O-Hep修饰糖蛋白的端位糖苷键转变为α构型(图2)。其次，研究表明AAH可以转移D,D-Heptose和L,D-Heptose至底物蛋白上，而TibC只能够以D,D-Heptose作为配体，表明不同BAHT介导不同构型的Ser-O-Hep修饰。

但仍存在以下问题：

包括但不限于上述致病菌中是否含有其他的Ser-O-Hep修饰？各种致病菌中不同BAHT介导的Ser-O-Hep修饰的配体立体选择性如何？如何靶向细菌表面的Ser-O-Hep修饰的粘附素从而实现细菌抗粘附治疗？

虽然目前存在着多种检测蛋白糖基化(如蛋白Ser/Thr-O-GlcNAc修饰或Asn-N-糖基化修饰)的手段和工具，但检测与探索病原细菌中特殊的Ser-O-Hep修饰尚缺乏相关工具，利用Ser-O-Hep修饰实现抗粘附治疗尚缺乏有效手段。

抗体作为一种重要的分子工具，具有极高的灵敏度与特异性，在蛋白的检测上发挥不可替代的作用。合成Ser-O-Hep修饰糖肽从而制备能够特异性靶向Ser-O-Hep修饰的多克隆抗体不仅能够加速对多种病原细菌中Ser-O-Hep修饰的探索，更为发展新一代小分子抗生素以及抗体类药物提供了新的机遇。