[发明专利]一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法

权利要求书

1.一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、外植体的取材与消毒

选择长势优良、无病虫害的金线莲植株，用流动水将植株洗净，去除根部及叶片，保留茎段作为外植体，在超净工作台中进行消毒处理；

S2、接种与诱导

将步骤S1消毒后的外植体切割成1-2cm的带节茎段，接种于诱导培养基中，在温度22-24℃、相对湿度60-65%、光照强度1000-1400lx、光照时间6-8h/d的条件下诱导丛生芽，培养时间为25-30d；

S3、继代增殖

将步骤S2诱导出的丛生芽切成具有2-4个不定芽的小块，接种在增殖培养基上，每21d继代1次，继代2-3次获得的试管苗作为种质保存材料；培养条件控制为温度22-24℃，相对湿度60-65%，光照强度1500-2000lx，避免直射，光照时间10-12h/d；

S4、试管苗变温盐胁迫诱导

将步骤S3获得的试管苗置于温度25℃、光照强度1500lx、光照14h与温度3℃、黑暗10h交替培养2d，然后用浓度为50mmol/LNaCl溶液处理1d，盐胁迫诱导试管苗；

S5、试管苗慢生长保存

将上述处理后的试管苗转接至种质保存培养基上，在培养基上覆盖一层无菌液体石蜡，然后置于温度10-15℃、相对湿度55-60%、光照强度400-600lx、每天光照12h的条件下使试管苗缓慢生长，每12个月继代一次，继代次数最多不超过4次；

S6、试管苗复壮

金线莲种质保存期结束后，将上述步骤中存活的试管苗转接到复壮培养基中使其恢复生长，培养条件控制为温度23-27℃，相对湿度60-65%，光照强度为1400-1800lx，避免直射，每天光照12-14h，培养时间为17-23d；

S7、试管苗生根

当复壮后的试管苗长到4-5cm时，将苗切成单株转接到生根培养基中，在温度23-27℃、光照强度2500-3000lx、每天光照13-15h的条件下诱导生根，培养时间为26-32d，可见试管苗叶色浓绿，根多粗壮；

S8、移栽

将试管苗连同组培瓶转移到炼苗大棚中，打开瓶口适应性炼苗7-10d；然后将试管苗从瓶中小心取出，洗去根部的培养基残留，将根部在质量分数为0.01%的高锰酸钾溶液中浸泡10min，然后移栽入大棚的栽培基质中，大棚的环境要求为温度 23-28℃，空气相对湿度80-90%，散射光照射，光照强度2600-3000lx，通风良好。

2.根据权利要求1所述的一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，其特征在于，所述步骤S1中外植体消毒处理的方法为：先用70%异丙醇消毒30s，无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞+3滴吐温20消毒8min，无菌水冲洗4-6次；最后用500mg/L聚乙烯吡咯烷酮浸泡6min，滤纸吸去多余水分后备用。

3.根据权利要求1所述的一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，其特征在于，所述步骤S2中诱导培养基的配方以MS为基本培养基，附加NAA 0.2mg/L、TDZ0.4mg/L、柠檬汁53mL/L、水解乳蛋白5.8g/L，pH 值为5.6~6.0。

4.根据权利要求1所述的一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，其特征在于，所述步骤S3中增殖培养基的配方以MS为基本培养基，附加6-BA2.0mg/L、NAA0.5mg/L、2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺0.9mg/L、酵母浸粉9g/L，pH 值为5.6~6.0。

5.根据权利要求1所述的一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，其特征在于，所述步骤S5中覆盖的无菌液体石蜡需高出培养基表面6-8mm。