[发明专利]一种抽提拟南芥种子高质量RNA的方法

说明书

本发明公开了一种抽提拟南芥种子高质量RNA的方法，包括：S1、将拟南芥种子在液氮中研磨成粉末并转移至第一离心管中；S2、向所述第一离心管中加入RNA提取试剂，震荡获得匀浆液；S3、将所述匀浆液在室温下孵育，而后离心，获得上清液；S4、在所述上清液中加入氯仿和浓度5mol/L的NaCl，充分混匀后再离心，获得上层水相；S5、将所述水相转移至一离心柱中并用RNeasy Mini Kit进行纯化，得到RNA样品。本发明的方法提取到的RNA样品质量好、纯度高、满足RNA‑Seq的试验要求且提取效率高。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其是涉及一种抽提拟南芥种子高质量RNA的方法。

背景技术

RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)是分子生物学研究的基础，优质、高纯度的RNA将极大地便利分子生物学和遗传学研究。拟南芥是遗传学研究的模式植物，从拟南芥中提取优质、高纯度的RNA将极大地方便分子生物学和遗传学等基础研究的开展。但与其它组织不同的是，拟南芥种子中往往含有较多的脂类、多糖、酚类和蛋白质等成分，严重影响RNA提取效率和提取质量。目前的提取方法常会遇到RNA产量不足、盐类或有机溶剂污染、样品降解等问题。

随着第二代、第三代测序技术(RNA-seq)的发展，其测序文库构建对RNA纯度、浓度和完整性均具有更高要求。然而，采用常规提取手段获得的RNA难以满足RNA-Seq类型试验对RNA质量的要求。因此，研究抽提拟南芥种子高质量RNA的方法研究显得尤为重要。

专利号为CN201410434938.4的发明专利公开了从烟草种子中提取RNA的方法，先用物理方法除去脂类物质，之后用醋酸钠和异丙醇重复沉淀RNA，并用DNaseI去除RNA中的基因组DNA；最终得到浓度高、质量好、完整性好的RNA，但上述方法并未证明能够适用于提取拟南芥种子RNA。

申请号为CN201610201835.2的专利文献公开了一种提取拟南芥种子中总RNA的方法，包括如下步骤：(1)在液氮冷却条件下研磨拟南芥种子获得冻干粉；(2)加入到预热的提取缓冲液中再加入β-巯基乙醇，涡旋混合后离心取上清；(3)加入氯仿和水饱和酚，涡旋混匀，18-25℃离心取上清；(4)加入氯化锂，静置离心得第一离心沉淀；(5)DEPC水溶解沉淀后加乙酸钠和异丙醇，静置离心得第二离心沉淀；(6)降低而离心沉淀经醇洗，干燥，复溶可获得较高质量的拟南芥种子RNA，但上述RNA提取方法获得产物是否可用于RNA-Seq仍未知。

发明内容

本发明的主要目的在于提出一种抽提拟南芥种子高质量RNA的方法，以从拟南芥种子中高效地提取出可用于RNA-Seq的高质量RNA。

本发明为达上述目的所提出的技术方案如下：

一种抽提拟南芥种子高质量RNA的方法，包括以下步骤：

S1、将拟南芥种子在液氮中研磨成粉末并转移至第一离心管中；

S2、向所述第一离心管中加入RNA提取试剂，震荡获得匀浆液；

S3、将所述匀浆液在室温下孵育，而后离心，获得上清液；

S4、在所述上清液中加入氯仿和浓度5mol/L的NaCl，充分混匀后再离心，获得上层水相；

S5、将所述水相转移至一离心柱中并用RNeasy Mini Kit进行纯化，得到RNA样品。

本发明上述方法所提取RNA质量好、纯度高，且RIN值可达7～8以上，除了可用于常规下游Q-PCR、RT-PCR试验外，其质量同样满足二代测序和三代测序(RNA-Seq)的文库构建需求；另外，本方法的提取流程更加简化，提取效率高，试验可重复性好。

优选地，步骤S1中进行研磨时，边研磨边不断地加入液氮。以此来保证拟南芥种子在研磨过程中的低温环境。