[发明专利]一种中华鳖基因组微卫星多重PCR体系构建方法

说明书

本发明公开了一种使用公共数据，快速构建中华鳖10×以上多重PCR体系的技术方法，其主要特征在于：1)使用公共数据库，获取中华鳖基因组序列；2)使用MISA软件对中华鳖基因组序列进行分析，使用Primer 3进行批量引物设计，使用使用AutoDimer软件计算多态位点引物序列的相容性；3)保留引物序列相容性最强的10‑12个位点构建多重PCR体系，按照每个位点上游引物0.4μM，下游引物10μM的浓度配制引物预混液，然后将全部位点的引物预混液等体积混合配制多重PCR引物工作液；4)使用常规PCR方法对多重PCR体系进行扩增，使用毛细管电泳对扩增产物进行基因分型。本发明构建的多重PCR体系，标记通量高，基因分型结果准确、快速，可为中华鳖遗传育种等研究工作提供分子工具。

技术领域

本发明涉及一种微卫星标记多重PCR体系的构建方法，特别是涉及了一种基于中华鳖基因组信息构建微卫星标记多重PCR体系的方法。

背景技术

微卫星标记是一种共显性的分子标记，由动、植物基因组中多次重复的重复单元(Motif，通常为1～6个碱基)和两侧的侧翼序列构成。微卫星标记具有变异程度高，在基因组中分布广泛，符合孟德尔遗传，易于PCR扩增等特点，是群体遗传、亲子鉴定、遗传管理中最常使用的分子标记。

微卫星标记传统上的基因分型方法是，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将PCR产物中不同片段大小的等位基因进行分离，通过银染方式对目的条带进行显色。理论上，聚丙烯酰胺凝胶电泳方法可以区分1bp-2bp碱基差异的等位基因，但该技术存在处理通量低的技术弊端，通常每个泳道通常只能处理一个位点或一组多重PCR体系，对于标记的扩增性及等位基因分布区间均有较为严格的要求。近年来，随着毛细管电泳技术的普及，利用荧光接头，构建微卫星多重PCR体系已经成为微卫星标记应用的主流技术。毛细管电泳使用液态基质，具有电泳速度快，分析精读高，可实现自动上样的技术优点，大大增加了微卫星标记的处理通量及基因分型的精度。同时，利用不同颜色荧光接头进行区分，可实现在一个上样孔同时对多组PCR产物的分型。

目前，制约微卫星标记多重PCR体系应用的技术难点在于，微卫星位点的开发项费时费力。近年来，随着下一代测序技术(NGS)的发展，公共数据库成为获取微卫星位点序列信息的重要资源。利用公共数据库的资源，通过生物信息学的分析手段，可以在短时间内筛选到大量的微卫星序列，用于后期的开发验证工作。

微卫星标记在水产动物的遗传育种研究中有着广泛的应用。不同于其他物种，多数水产动物具有极强的繁殖力，一对亲本可产生数以万计的子代个体，这无疑给水产动物的遗传管理增加了不小的技术难度。如何提高微卫星标记的应用效率，降低基因分型的成本，是水产动物分子标记辅助育种(MAS)顺利实施的重要保证。多重PCR体系构建，尤其是构建10×以上的PCR体系，为该问题解决提供了技术思路。

中华鳖是我国重要的名特优水产水产养殖品种，我国商品鳖目前的年产量基本稳定在33万吨，约占淡水养殖总量的1.2％。目前，中华鳖的人工选育工作已开展多年，但分子标记的开发研究却存在一定程度的滞后，这无疑阻碍了中华鳖遗传育种工作的研究进程。针对上述问题，本发明提供一种快速构建中华鳖10×以上多重PCR的技术方法，可为中华鳖家系鉴定，遗传育种以及群体遗传研究提供研究工具。

发明内容

本发明提供了一种使用公共数据，快速构建中华鳖10×以上多重PCR体系的技术方法，本发明具体的技术方案如下：

1、使用公共数据库，获取中华鳖基因组序列。

2、使用MISA软件对上述中华鳖基因组序列进行分析，查找和定位序列中的微卫星位点。

3、使用Primer 3对上述微卫星位点进行批量引物设计。

4、根据产物大小分布情况，将全部位点按照产物大小进行区间分组，每80bp-100bp设置一个分组区间；从每组中随机选取10-15个标记/套多重PCR体系，合成选取的全部位点的上下游引物。