[发明专利]一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法

说明书

本发明属于甲壳类动物基因工程技术领域，公开了一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法,斑节对虾ALFpm10抗菌肽由132个氨基酸组成，分子量为15.3kDa，信号肽由27个氨基酸组成；ALFpm10抗菌肽的cDNA全长517个碱基，可由斑节对虾血细胞的总RNA中通过RT‑PCR克隆获得；ALFpm10抗菌肽可通过原核表达系统，与SUMO蛋白融合表达获得，由固相化学合成的方法获得。本发明的ALFpm10抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌等具有抑菌、杀菌作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点，显示其在水产养殖行业具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于甲壳类动物基因工程技术领域，尤其涉及一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

近年来，我国渔业中的养殖和捕捞产量都跃居到了世界的前列，渔业经济发展十分迅速，水产养殖占到了全球养殖的70％。但是，随着我国水产养殖业精养、半精养等养殖模式的发展，集约化程度的日益提高，残饵、粪便、水生动植物尸体等富营养因子共存于一个水体，加之水源的污染和池塘自净与调节能力的降低，导致养殖水体中化学需氧量、生物耗氧量、氨氮、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，病原微生物种类和数量上升，养殖环境恶化导致鱼虾病害频频发生。

目前，针对集约化养殖导致养殖动物病害频发的主要防治方法是使用抗生素和化学药物，尤其是抗生素的大量使用给食品安全及出口贸易带来了巨大安全隐患，同时导致耐药病原增多、环境污染加剧、生态风险升高等一系列问题。抗生素滥用问题在水产养殖业尤其严重，我国已成为世界上滥用抗生素最严重的国家之一，2015年我国抗生素总使用量估计约18.2万吨，其中约52％用于农业、养殖业。因此，为了保障人民群众的饮食健康，提高产品品质出口创汇，增加养殖户的经济效益，急需寻找一种解决病害频发的方法，开发出绿色、环保、无害、高效的抗生素替代品，实现科学养殖、生产绿色产品。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体合成的一类小分子防御多肽，在抗生素替代和绿色养殖中具有重要意义，它是动物免疫防御体系在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，能提高生物非特异免疫活性，杀死入侵的微生物，具有活性高、特异性强等特点。研究表明抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞，在快速杀菌的同时，不会导致脓毒症，同时具有中和内毒素、调节增加机体免疫力等特性，使其最有可能替代抗生素成为新一代相对安全的抗菌药物。

直到1988年，年Takao和Shimonishi在鲎(Tachypleus tridentatus)血细胞里首次发现海洋生物抗菌肽—鲎素(tachyplesin)。近年来在海洋鱼类中发现了更多的抗菌肽，有的抗菌肽具有极强的抗菌活性，如Nakamura等(1996)从豹鳎(Pardachirus marmoratus)体内分离到的Pardaxin具有比蜂毒素更强的抗菌活性；Silphaduang和Noga等(2001)从杂交条纹鲈(Morone saxatilis♂×M.chrysops♀)中分离出的Piscidin对多种鱼类致病菌包括多重耐药菌株格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)均有较强抑杀作用,随后人们发现该家族的抗菌肽对病毒、真菌乃至寄生虫也均有抑制作用。

综上所述，现有技术存在的问题是：

至今仍未获得能快速杀灭病毒、弧菌等高危病害菌的对虾抗菌肽。对虾属于非脊椎动物，关于它的基础研究比较薄弱，免疫机理尚不完全清楚，抗菌肽的种类及作用机理都在研究之中。虽然，对于对虾养殖技术、饲料等应用研究比较成熟，国内也形成了大规模的养殖产量，但是基础研究的欠缺导致对虾病害频繁发生且没有获得科学的理论指导，至今未获得具有高效杀菌活性且可应用于对虾病害防治的对虾抗菌肽。

解决上述技术问题的难度和意义：