[发明专利]一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法

权利要求书

1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；

所述斑节对虾ALFpm10基因的cDNA序列SEQ ID NO：4；信号肽序列为SEQ ID NO：2；

斑节对虾抗菌肽ALFpm10的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQ ID NO：3。

2.一种如权利要求1所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法包括：

通过原核表达系统获得，将ALFpm10的基因序列连接到pET-28a、pCold IV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO- ALFpm10融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm10抗菌肽。

3.如权利要求2所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，ALFpm10的基因获得方法包括：

斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理3h的斑节对虾血细胞，采用试剂盒提取血细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；

根据ALFpm10的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5' GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，获得517bp的特异性cDNA片段，经测序得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。

4.如权利要求2所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，具体包括：

1）斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取：

血细胞的收集：先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟，用1mL抗血清洗涤细胞，即可用于后续的总RNA提取；

总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的总RNA，吸取不超过1×10⁷个细胞，5000rpm离心5min，去上清；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70%乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的Buffer RPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；

2）抗菌肽cDNA序列的克隆：

根据斑节对虾ALFpm10抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5' GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG 3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC 3'，采用RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15 min，获得斑节对虾的cDNA；以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得约517bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取517bp的目的片段，采用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到T-vector上，进行基因测序，得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。

5.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于， 步骤1），斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取中，

先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟。