[发明专利]检测大肠杆菌含量的试剂盒、特异性引物和探针及应用

说明书

本发明提供了一种一组大肠杆菌特异性引物和探针序列，从而建立一种能应用于大鼠死后心血中大肠杆菌含量检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。根据本发明的一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，特异性引物和探针以保守片段序列为靶目标。本发明采用基因克隆技术，将大肠杆菌LacZ基因特异性片段插入到载体pMD18‑T中，获得含有LacZ基因特异性片段的重组质粒，以此作为标准品。根据大肠杆菌LacZ基因特异性片段序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

技术领域

本发明属于本发明属于分子生物学和体外诊断试剂技术领域，特别涉及死后大肠杆菌的检测。

背景技术

β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)编码，是由4个亚基组成的四聚体，一般可催化乳糖分解为一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。从不同物种提取的β-半乳糖苷酶的蛋白质序列有着较高的同源性和相似性。β-半乳糖苷酶的分子质量在100～850ku之间，其中大肠杆菌的β-半乳糖苷酶分子质量最大，为520～850ku。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是腐败菌的主要菌群之一，是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，几乎占粪便干重的1/3。在个体死后，大肠杆菌属于具有较强分解蛋白质能力的腐败菌种，且由于其周身鞭毛能运动，最易出现细菌移位(bacterial translocation,BT)，个体健康存活时，血液中是不存在或仅存在极少量细菌的，否则将引起菌血症方面的疾病。当个体死后，细胞开始出现变性、死亡，然而细菌则继续生长，紧接着肠粘膜屏障功能受损以致功能消失，大量大肠杆菌出现移位，部分大肠杆菌出现在血液中，目前，国内外将实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)技术运用于检测尸体样本中腐败菌DNA含量的研究极少有报道，并且现有检验死亡时间的手段对检验人员的经验要求较高。

发明内容

针对现有技术的缺陷与不足，本发明运用qPCR技术，以大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)为目的基因，构建qPCR扩增体系，通过检测不同死亡时间下的腐败菌LacZ基因含量，建立两者之间的相关性，根据这种相关性，检测未知死亡时间的血样中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间，具有非常重要的研究前景和应用价值。

PCR技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。Taq Man探针法检测特异性强，灵敏度高，本发明优化反应条件，其中一种应用能够用于大鼠死后心血中大肠杆菌含量的快速检测。

本发明的其中一个目的在于设计一组大肠杆菌特异性引物和探针序列，从而建立一种能应用于动物死后心血中大肠杆菌含量检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将大肠杆菌LacZ基因特异性片段插入到载体pMD18-T中，获得含有LacZ基因特异性片段的重组质粒，以此作为标准品。根据大肠杆菌LacZ基因特异性片段序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

根据本发明的一方面，提供了一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，特异性引物和探针以保守片段序列内序列为靶目标，保守片段序列为SEQ No.1：