[发明专利]检测大肠杆菌含量的试剂盒、特异性引物和探针及应用

权利要求书

1.用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针以保守片段序列内序列为靶目标，所述保守片段序列为SEQ No.1。

2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：

所述探针序列如SEQ No.2：5’-ACCGCTGGGATCTGCCATTGT-3’；

所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物序列如SEQ No.3：5’-ACTATCCCGACCGCCTTACTG-3’，

下游引物序列如SEQ No.4：5’-GCGCAGACCGTTTTCGCTCGG-3’。

3.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物序列为以所述SEQ No.3和SEQ No.4为基础向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

4.根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，所述探针3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

5.用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1至4中所述任意一种用于检测大肠杆菌的特异性引物和探针。

6.根据权利要求5所述的用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在20μl PCR反应体系中，所述上游引物PCR终浓度为0.5μM，所述下游引物PCR终浓度为0.5μM，所述探针PCR终浓度为0.2μM。

7.根据权利要求5或6所述的用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；所述系列浓度标准品是将大肠杆菌LacZ基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。

8.根据权利要求7所述的用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准品的核苷酸序列如SEQ No.1。

9.检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：权利要求5至8中任意一种检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒的应用如下任意一种用途：

(1)定性或定量检测或辅助检测大肠杆菌；

(2)测定大鼠死后心血中大肠杆菌含量，进而推断死亡时间；

(3)尸检中推断死亡时间；

所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

10.推断死亡时间的方法，其特征在于：测定动物死后心血中大肠杆菌含量进而推断死亡时间；所述测定动物死后大肠杆菌含量使用权利要求5至8中任意一种用于检测大肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒。

11.根据权利要求10所述的一种推断死亡时间的方法，其特征在于：分别以系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。

12.根据权利要求11所述的一种推断死亡时间的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min并收集荧光信号，40个循环。