[发明专利]一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法

说明书

本发明公开了一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法，其分类黑曲霉菌株Aspergillus niger 101‑HAC11，保藏号CGMCC No.12480。同时也公开了以淀粉糖质为碳源发酵生产柠檬酸的培养基配方及发酵过程控制工艺。采用该菌株生产柠檬酸的产量可达166.8g/L。与现有技术相比，该重组黑曲霉菌株柠檬酸产量为220.34 g/L，产量提高了32.10%。该方法具有快速，生产工艺流程简单、产品无毒性残留，安全性高的特点。

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及基因工程构建高发酵强度的黑曲霉菌株应用淀粉糖质发酵产生柠檬酸的方法。更具体的说是：一株基因工程构建高发酵强度的黑曲霉菌株，以淀粉糖质为发酵碳源添加其它有机和无机氮源，及必须的金属盐成分发酵生产柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸（Citric acid）是一种常见的有机酸，在食品饮料、医药化工、化妆品行业应用广泛，是目前世界需求量最大的一种有机酸。

1784年C.W.舍勒利用柠檬酸钙沉淀法制得柠檬酸。19世纪末生物发酵法雏形初成。1916年，大多数曲霉菌如米曲霉、泡盛曲霉、绿色木霉和温氏曲霉以及黑曲霉被汤姆和柯里实验证实都可生产柠檬酸，而黑曲霉则居于榜首。20世纪中以前，浅盘发酵法是主流，1923年世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂在美国菲泽公司。1950年后，逐渐建立起深层发酵法。深层发酵相较于浅盘发酵法，周期较短，产率更高，占地面积小，劳动力更省，对于工业化生产十分有利，现已成为柠檬酸生产的主要方法。

中国最早于1942年汤腾汉等人的报告中讲述了发酵法制取柠檬酸。1952年开始用浅盘发酵法制取柠檬酸。1959年轻工业部发酵工业科学研究所的200L规模深层发酵制柠檬酸试验初步成功，1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所先后采用以薯干粉为原料，深层发酵制取柠檬酸，并相继获得成功，从而确定了中国生产柠檬酸的一条主要工艺路线。2000年以来至今，我国柠檬酸生产以玉米粉经高温喷射液化糖液，应用黑曲霉菌株液态深层发酵生产柠檬酸，采用钙盐法和硫酸酸解分离提取柠檬酸。随着我国发酵工业的技术进步，及对生产过程的环境保护要求日益提高，该工艺生产柠檬酸已经无法达到高强度发酵柠檬酸的要求。

主要原因有以下几个问题：

(1)应用玉米粉液化液并带有部分玉米渣共同发酵，导致发酵醪液粘稠，目前发酵醪液总糖在17%-18%，如果增加醪液的总糖会使料液粘稠度进一步增加，发酵过程为达到溶氧要求通风和搅拌能耗过大，无法实现工业化，这样单罐产酸就被限制在18%左右，无法提升。

（2）玉米液化液中含有糊精、寡糖、低聚糖、麦芽糖、异麦芽糖等多种糖类，并含有不同种类的蛋白质，导致发酵产物复杂，产生多种杂酸。发酵醪液成分多样，为柠檬酸分离提取带来困难，目前柠檬酸提取采用钙盐法，最有利于杂酸的去除，但同时会产生硫酸钙废渣无法处理，形成工业生产废渣。由于发酵醪液难以分离纯化柠檬酸，所以一直沿用钙盐法提取柠檬酸，而硫酸钙已经成为各柠檬酸生产公司的固废隐患。

（3）目前柠檬酸发酵结束，发酵固废中黑曲霉菌丝球与不能利用的玉米渣混合在一起，只能干燥进入饲料市场，而黑曲霉菌丝球完全可以用来提取氨基葡萄糖质和甾醇等高附加值产品。

（4）由于柠檬酸发酵采用玉米粉液化液为原料，受到玉米质量的极大影响，如玉米籽粒烘干温度、玉米产地、玉米品种、玉米贮存时间等都会影响玉米液化液中的碳氮比例，导致发酵过程不稳定，影响柠檬酸生产。

（5）目前柠檬酸发酵采用玉米粉液化液为原料，导致发酵过程中溶氧和pH测定和控制困难，发酵过程自动化控制和连续化生产无法实现。

综合上述原因，发展以淀粉糖质为原料的柠檬酸发酵势在必行。

基于淀粉糖质发酵柠檬酸工艺有以下优势：