[发明专利]一种检测以DAP12作为胞内信号结构CAR-T细胞的方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测以DAP12作为胞内信号的CAR‑T细胞的方法，采用SEQ ID NO:1所示的上游引物、SEQ ID NO:2所示的下游引物和SEQ ID NO:3所示的探针进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。本发明方法为：使用基因组DNA提取试剂盒，提取CAR‑T细胞基因组，建立快速定量检测体外培养或临床治疗后患者体内CAR‑T细胞数。本发明公开的一种检测外周血中以DAP12作为胞内信号结构的CAR‑T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法及相关试剂盒，可用于检测所有以DAP12作为胞内信号结构的CAR‑T细胞。该方法可在2h内，检测出3.9×10¹‑3.9×10⁷copies/μl范围内的CAR‑T细胞进行准确定量。本发明建立的检测方法，特异性强，定量准确，检测快速，使用范围广。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种检测以DAP12作为胞内信号结构的CAR-T细胞的方法及其试剂盒。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。在与表达scFv的同源抗原的靶细胞相互作用时，在T细胞上表达的CAR的表达引起T细胞激活杀伤靶细胞。目前CAR这些研究采用的是在scFv和CD3ζ链胞内结构域融合形成嵌合受体的基础上，加入4-1BB或CD28共刺激分子的第二代CAR-T细胞，以及在第二代CAR-T细胞的基础上，将两个共刺激分子4-1BB和CD28进行串联的第三代CAR-T细胞。这些CAR都是基于单一嵌合分子设计的能够引发抗原特异性T细胞应答，但天然免疫受体通常是由分开的配体结合区和含ITAM的信号链组成的多链复合物，例如T细胞受体TCR-CD3复合物。多链免疫受体复合物的潜在益处是多方面的，包括通过配体结合和信号传导分子之间的多重相互作用获得的更大的信号多样性，以及持续的ITAM信号传导。相关研究报道新一代的CAR以跨膜受体DAP12与杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)组合形成CAR的信号传导结构[Generation of potent T-cellimmunotherapy for cancer using DAP12-Based multichain chimericimmunoreceptors.Cancer Immunology Research,2015,3(7):815-826.]，在众多配体中，DAP12由于能够和多种激活型受体结合形成免疫激活型复合物进而通过磷酸化Syk或Zap70介导激活型的信号受到格外关注。

CAR-T细胞检测是临床应用中判断CAR-T药效安全性与持久性至关重要的参数，传统的CAR-T细胞检测方法是通过流式检测T细胞表面CAR的表达，但是该方法成本高，耗时长，更重要的是灵敏度低，应用范围狭窄，每一种CAR结构都需要独立的一套检测试剂，不具备通用性。因此，开发能准确检测CAR-T细胞的荧光定量PCR体系，用于准确判断CAR-T临床治疗的癌症患者体内CAR-T细胞数量，进而明确CAR-T药物的增殖趋势和药效持久性，是本领域的技术人员一直致力解决的问题。

发明内容

本发明目的在于公开了一种检测外周血中以DAP12作为胞内信号结构的CAR-T细胞的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法及相关试剂盒，可用于检测所有以DAP12作为胞内信号CAR-T细胞，有效解决了传统检测方法成本高，耗时长，灵敏度低，应用范围狭窄，缺乏通用性等问题。

本发明所述的目的通过以下方案具体实现：