[发明专利]用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌等弯曲菌的快速分离纯化培养方法。该方法包括以下步骤：无菌采集动物粪便病料，装入PBS液中备用。取含有目的样品的PBS液加到过滤器1中，将过滤器1放入到收集器1中，11000 rpm‑13000 rpm离心0.5‑2 min；将过滤器1中的滤液取出放入到过滤器2中，将过滤器2放入到收集器2中，11000 rpm‑13000 rpm离心0.5‑2 min；取过滤器2中的液体均匀涂于平板培养基中培养48‑72 h；挑取单菌落接种至纯化培养基中进行纯化。本发明方法适合于从动物粪便等复杂基质中对弯曲菌进行分离纯化，提高样品中弯曲菌的分离率和检出率。可避免因用添加抗生素类药物的选择性培养基而造成弯曲菌难分离及分离率低等难题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌等弯曲菌的快速分离纯化培养方法。

背景技术

弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。各种动物（特别是猪、鸡、牛、羊）都能患病，除可引起腹泻外，还可造成牛、羊和犬的流产、不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。对人除可引起腹泻和食物中毒外，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。

引起动物和人类疾病的主要是空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌。弯曲菌的菌体纤细，呈螺旋形、撇行、S形和鸥形等多种形态。在老龄培养物中呈螺旋状长丝或圆球形，运动力活泼。革兰氏染色阴性，微需氧，对营养要求较高。在含10%二氧化碳的环境中生长良好，于培养基内添加血液、血清有利于初代的培养。

研究表明弯曲菌能产生细胞膨胀致死毒素，其有三个亚型，即A型，B型和C型。细胞膨胀致死毒素与弯曲菌致病性、出血性腹泻、食物中毒、食品安全密切相关。动物感染弯曲菌后，可随粪便排菌，也可通过牛乳和其他分泌物排出，造成污染。猪、禽在宰杀和加工过程中肉品被污染，容易引起暴发。鸡和猪肠道中带菌率相当高，特别是鸡，可达50%-90%，已成为本病流行病学的一个重要问题。禽类感染本菌主要引起肝炎变化。

雏鸡感染后常表现精神沉郁和腹泻。病的严重程度取决于鸡的日龄和菌株的毒力，环境应激因素可加重病情。剖检变化主要是肠管鼓胀，肠腔积有黏液和水样内容物，如病菌毒力腔，可能见到出血变化。开产前后的母鸡感染后表现精神沉郁，体重减轻，鸡冠发白、干燥、萎缩，常有腹泻，产蛋率下降25%-35%，病死率一般为2%-15%。死后剖检最明显的病理变化是肝肿大、褪色，有星状黄色小坏死灶散播于整个肝实质内，肝被膜下有大小不等的出血灶，严重者肝变脆，并满布菜花样大坏死灶区；慢性病例肝变硬并萎缩，常伴有腹水或心包积液。由于鸡肝脏发生炎症和坏死，又称为鸡弯曲菌性肝炎或鸡传染性肝炎。

人感染后，潜伏期一般为3-5d, 病情轻重不一。典型病人先有发热，全省无力，头痛，肌肉酸痛，婴儿还可发生抽搐临诊症状。继而腹痛，常局限于脐周，呈间歇性，有的呈隐痛，排便后可缓解。发热12-24h后开始腹泻，呈水样，每天排便5-10次，1-2d后部分病例出现黏液便或脓血便，经过1周可自行缓解，少数病例腹痛可持续数周，反复发生腹泻。近年来，弯曲菌常引起儿童肠道外感染，如败血症、脑膜炎、胆囊炎、腹膜炎、心内膜炎、血栓性静脉炎和反应性关节炎等。

根据流行病史和临诊表现可怀疑为本病，确诊需进行细菌的分离鉴定。但弯曲杆菌分离较为困难，生长缓慢，往往不容易分离到，不利于养殖户和规模化企业采取相应的措施和药物来进行及时的预防和治疗。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，本方法操作简便、省工省时，可以提高弯曲菌的分离效率，为弯曲菌病原临床诊断和检测提供技术支持和理论基础。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：一种用于弯曲菌的快速分离纯化培养方法，包括以下步骤：