[发明专利]过表达miR-125a-5p慢性病毒载体构建方法及其应用

说明书

本发明公开了过表达miR‑125a‑5p慢性病毒载体构建方法及其应用，构建方法是依据GenBank中has‑miR‑125a‑5p序列，从miRBase中获得成熟的hsa‑miR‑125a和前体序列hsa‑pre‑miR‑125a；依据has‑miR‑125的序列及慢病毒载体GV369，引入酶切位点AgeI/NheI，调取根据miRNA过表达载体设计原则，设计引物序列，通过PCR调取目的片段；PCR扩增miR‑125a后，经电泳鉴定，酶切，PCR产物与载体进行交换，转化；获取含有miR‑125a片段的慢病毒载体GV369‑miR‑125a。其主要是在制备改善厄洛替尼耐药性药物的应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，特别涉及一种过表达miR-125a-5p慢性病毒载体构建方法及其应用。

技术背景

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居高不下，死亡率居男性恶性肿瘤之首。按组织学类型，肺癌可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)，其中NSCLC占85％左右。目前肺癌的治疗方式仍是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗，由于大多数肺癌患者在明确诊断时已处于晚期，其5年生存率仅在17％左右。近年来，随着对肿瘤发病机制及生物学行为研究的不断深入，分子靶向治疗成为了肿瘤治疗的主要方法之一，其以特异性高、不良反应轻且疗效肯定，受到了人们的广泛关注。

分子靶向治疗是以肿瘤细胞的标志性分子为靶点，通过使用有效的阻断剂抑制肿瘤细胞增殖、干扰细胞周期、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成等途径达到治疗肿瘤的目的。目前已研制的肿瘤分子靶向药物有很多类，其中，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是NSCLC主要的靶向药物之一，它通过抑制肿瘤细胞表面的酪氨酸激酶受体EGFR介导的下游信号通路而发挥作用，包括MAPK-ERK1/2(mitogen active protein kinase-extracellular regulated protein kinase)和磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶通路(phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/AKT)。迄今为止，EGFR-TKIs代表药物有第一代吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼，第二代阿法替尼以及第三代奥希替尼(AZD9291)等。多项临床试验结果显示，对有EGFR基因突变阳性的NSCLC患者，EGFR-TKIs有显著的疗效，能使患者的中位无进展生存期(progression-free survival，PFS)延长至9-13(AUROR研究显示第三代一线使用的PFS是16.8个月)个月。然而，不可避免的是，这些靶向药物在起效一段时间后最终会导致耐药。