[发明专利]PRRSV5’UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法

说明书

本发明通过转染PRRSV 5’UTR RNA转录物进入PAM细胞模拟PRRSV感染靶细胞启动炎症反应的过程，同时给予LPS刺激，建立PRRSV 5’UTR RNA转录物/LPS混合感染模型。相较于直接用PRRSV感染细胞，采用PRRSV 5’UTR RNA转录物在研究药物的抗炎机理时，可以排除药物对病毒的直接杀灭作用，该模型的建立以期为研究PRRSV和细菌混合感染诱导炎症反应的机理以及评价药物对该混合感染造成的炎症反应的影响提供研究模型。

技术领域

本发明涉及一种免疫细胞炎症模型的建立方法，具体涉及一种PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法。

背景技术

炎症是临床最常见的病理过程，目前针对炎症的研究在体外主要是采用LPS进行造模，但在兽医临床病例中往往是多种病原的混合感染，尤其是病毒与细菌的混合感染。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是目前对全球养猪业构成巨大威胁的一类高度接触性传染病，PRRS可导致病猪产生严重的多器官全身性炎症反应，尤其是肺部。PRRSV主要攻击猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolarmacrophage，PAM），破坏机体免疫系统，导致猪群免疫抑制，引起一些病毒性或细菌性疾病的继发感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法。

本发明一种PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，通过转染PRRSV 5’UTR RNA转录物进入PAM细胞模拟PRRSV感染靶细胞启动炎症反应的过程，同时给予LPS刺激(抗原)，建立PRRSV 5’UTR RNA转录物与LPS混合感染模型。

进一步的，体外转录PRRSV 5’UTR RNA包括以下步骤：

（1）重组质粒pcDNA3.1（+）-5’UTR的制备；

（2）PRRSV 5’UTR RNA的制备。

进一步的，PAM细胞的获取方法为筛选4-6周龄PRRSV和PCV2抗原抗体均为阴性的仔猪，获取猪肺泡巨噬细胞（PAM），具体包括以下步骤：

（1）猪麻醉后，分离气管、食管和肺脏，PBS洗干净肺脏表面，放入超净台中；

（2）止血钳夹紧一侧气管，沿气管注入PBS，轻轻拍打肺脏表面，小心将冲洗液倒入烧杯中；

（3）PBS重复冲洗肺脏2-3次，收集冲洗液；

（4）混匀冲洗液，经8层无菌纱布过滤至新的烧杯中；

（5）混匀过滤好的冲洗液，1500 rpm/min，离心5min，收集细胞；

（6）1640培养基重复洗2次；

（7）1640培养基重悬细胞，计数。调整细胞密度为1×10⁷/mL后冻存细胞。

进一步的，所述重组质粒pcDNA3.1（+）-5’UTR的制备包括以下步骤：

（1）PRRSV感染Marc-145细胞24 h后，收取细胞样品，采用Trizol法提取细胞总RNA；

（2）普通PCR扩增PRRSV 5’UTR，琼脂糖凝胶电泳后，用TIAGEN胶回收试剂盒胶回收特异性条带；

（3）对胶回收产物进行双酶切；

（4）T4连接酶连接目的基因（双酶切产物）和载体pcDNA3.1（+）DNA；