[发明专利]PRRSV5’UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法

权利要求书

1.一种PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：通过转染PRRSV 5’UTR RNA转录物进入PAM细胞模拟PRRSV感染靶细胞启动炎症反应的过程，同时给予LPS刺激，建立PRRSV 5’UTR RNA转录物与LPS混合感染模型。

2.根据权利要求1所述的PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：体外转录PRRSV 5’UTR RNA包括以下步骤：

(1)重组质粒pcDNA3.1(+)-5’UTR的制备；

(2)PRRSV 5’UTR RNA的制备。

3.根据权利要求1所述的PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：PAM细胞的获取方法为筛选4-6周龄PRRSV和PCV2抗原抗体均为阴性的仔猪，获取猪肺泡巨噬细胞(PAM)，具体包括以下步骤：

(1)猪麻醉后，分离气管、食管和肺脏，PBS洗干净肺脏表面，放入超净台中；

(2)止血钳夹紧一侧气管，沿气管注入PBS，轻轻拍打肺脏表面，小心将冲洗液倒入烧杯中；

(3)PBS重复冲洗肺脏2-3次，收集冲洗液；

(4)混匀冲洗液，经8层无菌纱布过滤至新的烧杯中；

(5)混匀过滤好的冲洗液，1500rpm/min，离心5min，收集细胞；

(6)1640培养基重复洗2次；

(7)1640培养基重悬细胞，计数。调整细胞密度为1×10⁷/mL后冻存细胞。

4.根据权利要求2所述的PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述重组质粒pcDNA3.1(+)-5’UTR的制备包括以下步骤：

(1)PRRSV感染Marc-145细胞24h后，收取细胞样品，采用Trizol法提取细胞总RNA；

(2)普通PCR扩增PRRSV 5’UTR，琼脂糖凝胶电泳后，用TIAGEN胶回收试剂盒胶回收特异性条带；

(3)对胶回收产物进行双酶切；

(4)T4连接酶连接目的基因(双酶切产物)和载体pcDNA3.1(+)DNA；

(5)50μL DH-5α感受态细胞与连接产物冰上孵育30min，42℃热激60s，冰上孵育3min，加入250μL LB液体培养基，37℃，220rpm/min孵育1h；

(6)将上一步的产物涂到LB固体板上，正置吸收后，倒置37℃培养。根据菌落的生长情况，挑取单菌落，放入LB液体培养基中，37℃220rpm/min摇菌12h；

(7)用OMEGA质粒提取试剂盒提取菌液质粒DNA，将质粒DNA送华大基因测序，用30％甘油保菌，测序结果经NCBI Blast与PRRSV 5’UTR序列一致。

5.根据权利要求2所述的PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：所述PRRSV 5’UTR RNA的制备包括以下步骤：

(1)将100μL上述保存的菌种加入到4mL的LB液体培养基中，37℃220rpm/min摇菌12h，提取质粒DNA；

(2)将质粒DNA进行单酶切(Xho I)，37℃3h；

(3)将酶切产物进行线性化纯化，ND-核酸浓度测定仪测定纯化后的DNA浓度；

(4)参照Promega公司RiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7试剂盒(P1300)进行体外RNA转录，37℃反应4h；

(5)将步骤(4)中反应得到的RNA进行转录纯化；

(6)ND-核酸浓度测定仪测定纯化后RNA的浓度，并用琼脂糖凝胶对纯化后的RNA进行验证。

6.根据权利要求4所述的PRRSV5'UTR转录物与LPS共感染细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：步骤(3)中双酶切所用酶为BamH I和Xho I限制性内切酶，均购自北京NEB公司。