[发明专利]一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用，属于基因工程、蛋白表达与纯化及酶学特征研究领域，该氨肽酶LapA来源于嗜肺军团菌，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该编码基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该酶作为一种外切蛋白酶，具有良好的温度稳定性以及有机溶剂耐受性，能适应极端的高浓度有机溶剂反应条件，为氨肽酶LapA的产业化和在发酵食品加工工业的应用奠定了良好的基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术、蛋白表达与纯化及酶学特征研究领域，具体涉及一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA、其编码基因和应用、其重组大肠杆菌及其构建方法、LapA蛋白的体外表达与纯化的方法和LapA酶学性质鉴定。

背景技术

肽酶(EC 3.4)在洗涤剂，皮革，药物和食品工业中具有广泛应用，肽酶占全球酶市场的65％。肽酶是食品工业中提高消化率和溶解度以及食品蛋白质的风味和功能特性的有力工具。之前研究的大多数肽酶都是内切蛋白酶，近几十年来，外切蛋白酶由于其与内切蛋白酶和特定功能的不同切割位点而引起了很多关注。内切蛋白酶通常切割肽链内的肽键，产生各种长度的肽。外切蛋白酶通过去除单个氨基酸或二肽/三肽攻击末端(即N或C端)的肽链，导致释放游离氨基酸和小肽。氨肽酶LapA(EC 3.4.11)是外切蛋白酶家族的成员，其选择性地从肽中去除N端氨基酸残基。氨肽酶LapA的引入已经成为提高蛋白质水解效率的重要途径，当蛋白质大分子酶解时，肽链中含有的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾而呈现苦味，而这些疏水性氨基酸一般位于肽链末端，而利用氨肽酶LapA进一步水解蛋白质水解液，可以脱去其苦味。尽管在食品工业中已经使用了许多商业氨肽酶LapA，但应用氨肽酶LapA的主要挑战之一是发现它们在极端温度，pH和有机溶剂中进行催化的独特能力。例如对于一些食物发酵过程，作为副产物的乙醇会影响许多酶的活性。因此，氨肽酶LapA具有很高的研究价值以及在酒精发酵食品加工工业中的应用潜力。

基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，在体外将分离到的或合成的目的基因,通过与质粒、病毒等载体重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用，提供了该氨肽酶LapA体外重组表达纯化的方法，并鉴定出该酶为一种能够适应极端条件下催化需求的高性能氨肽酶LapA。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该氨肽酶LapA来源于嗜肺军团菌，为一种外切蛋白酶，该氨肽酶LapA也可通过化学合成方法获得。

本发明还提供了一种产上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)基因克隆：以SEQ ID NO.1所示的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因为目标基因，设计特异性扩增引物，在引物中引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点，进行PCR扩增，获得含有NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点的目的基因片段；

(2)构建重组质粒：将含有NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点的目的基因片段经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到经过同样处理的载体pET-28a上，获得重组质粒；

(3)构建重组大肠杆菌：将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞，获得产有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌。

本发明还提供了一种上述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的体外表达与纯化方法，包括以下步骤：