[发明专利]一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述氨肽酶LapA为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或乙腈，所述极端环境指在高浓度有机溶剂反应条件下，所述高浓度有机溶剂指浓度为20％的有机溶剂。

2.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)基因克隆：以SEQ ID NO.1所示的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因为目标基因，设计特异性扩增引物，在引物中引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点，进行PCR扩增，获得含有NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点的目的基因片段；

(2)构建重组质粒：将含有NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点的目的基因片段经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到经过同样处理的载体pET-28a上，获得重组质粒；

(3)构建重组大肠杆菌：将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞，获得产有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的重组大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的体外表达与纯化方法，包括以下步骤：

(Ⅰ)将如权利要求2中的方法构建获得的重组大肠杆菌进行扩大培养，待菌液OD₆₀₀到达0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG，16℃摇床中培养20h，进行诱导表达；

(Ⅱ)5000rpm离心10min，弃去上清，菌体用pH8.0的20mM Tris-HCl，200mM NaCl缓冲液重悬，超声破碎仪破碎，4℃低温条件下12000rpm离心30min，取上清液；

(Ⅲ)将上清液上样过Zn²⁺螯合亲和层析柱，柱子事先依次过5个柱体积超纯水、10个柱体积50mM pH5.0 NaAc、10个柱体积超纯水、5mL 100mM ZnCl₂、10个柱体积超纯水及蛋白重悬缓冲液；然后用5个柱体积的蛋白重悬缓冲液过柱，再依次用5-10个柱体积的含有5mM-1M咪唑的蛋白重悬缓冲液过柱，收集各洗脱液，即为洗脱蛋白样品；

(Ⅳ)将洗脱蛋白样品用超滤离心管浓缩到5ml后，过凝胶层析柱，层析柱事先用蛋白重悬缓冲液平衡好，并用缓冲液进行洗脱；设置层析柱的柱压为0.5MPa、流速为1ml/min，即获得氨肽酶LapA。

4.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的酶学性质鉴定方法，步骤包括：以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，在不同的反应条件下，利用所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA催化L-亮氨酸-对硝基苯胺转化为对硝基苯胺，通过测定反应液在405nm处的吸光值，计算获得该LapA的酶学性质参数。

5.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受性氨肽酶LapA在极端环境下作为蛋白质的外切蛋白酶的应用，其特征在于，所述有机溶剂耐受性氨肽酶LapA的编码基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。