[发明专利]用于检测血清外泌体pIgR的试剂在制备诊断原发性胆汁性胆管炎并预测其疗效的试剂盒中的应用及应用

权利要求书

1.一种用于检测血清外泌体pIgR的试剂在制备诊断原发性胆汁性胆管炎并预测其疗效的试剂盒中的应用，其特征在于：该试剂盒中包括下述组分：

pIgR标准品；

pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；

样本稀释液：质量浓度0 .1％的BSA-PBS溶液；

辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

2.根据权利要求1所述的用于检测血清外泌体pIgR的试剂在制备诊断原发性胆汁性胆管炎并预测其疗效的试剂盒中的应用，其特征在于：所述样本稀释液为牛血清白蛋白加入pH7 .4的0 .01M磷酸盐缓冲溶液中充分溶解，每升磷酸盐缓冲溶液中加入1克牛血清白蛋白；

所述底物显色液为TMB/H2O2，所述反应终止液为：0 .5M硫酸，清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液。

3.根据权利要求2所述的用于检测血清外泌体pIgR的试剂在制备诊断原发性胆汁性胆管炎并预测其疗效的试剂盒中的应用，其特征在于：所述底物显色液由底物显色液A和底物显色液B等体积混匀混合而成；

其中底物显色液A有四甲基联苯胺(TMB)、DMSO、EDTA-Na、柠檬酸、甘油，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液A中有甲基联苯(TMB)40mg、DMSO4ml、EDTA-Na40mg、柠檬酸190mg、甘油10ml；

底物显色液B有醋酸钠、柠檬酸、30％过氧化氢(H2O2)，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液B中含有醋酸钠2.72g、柠檬酸0.32g、30％过氧化氢(H2O2)60ul。

4.根据权利要求2所述的用于检测血清外泌体pIgR的试剂在制备诊断原发性胆汁性胆管炎并预测其疗效的试剂盒中的应用，其特征在于：所述清洗缓冲液由吐温加入pH7 .4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L中溶解制成，其中每1L磷酸盐缓冲溶液中加入500ul的吐温。

5.如权利要求1所述的用于检测血清外泌体pIgR的试剂在制备诊断原发性胆汁性胆管炎并预测其疗效的试剂盒中的应用，其特征在于：试剂盒的应用方法包括以下步骤：

(1)将获取的血清样本于2500-3500g常温离心10-20分钟，用微量移液器抽取上层清液至另一干净灭菌管中，加入外泌体提取试剂轻轻上下颠倒摇匀，每100μl血清样本中加入25μl的外泌体，3.8-4.2℃静置25-35分钟，取1200-1700g常温离心25-35分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体，用0 .1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释形成样本稀释液；

(2)用0 .1％BSA-PBS溶液稀释pIgR标准品为8个梯度：pIgR含量分别为8RU/ml、4RU/ml、2RU/ml、1RU/ml、0 .5RU/ml、0 .25RU/ml、0 .125RU/ml、0RU/ml；第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接采用样本稀释液；

(3)在pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul的稀释好的标准品和样本稀释液，室温孵育25-35分钟；弃去微孔板孔中液体，每孔加等量配好清洗缓冲液，50-70秒后将微孔板孔中液体倒出，去除残留液体，清洗缓冲液重复清洗3次；

(4)每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育25-35分钟后，弃去孔中液体，用清洗缓冲液清洗3次；

(5)每孔加入100ul显色液，室温孵育13-17分钟，再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应；

(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中pIgR浓度。