[发明专利]一种高通量检测多种靶基因的方法

说明书

本发明提供了一种高通量检测多种靶基因的方法以及试剂盒，属于PCR基因检测技术领域，包括以下步骤：设计荧光标记探针；筛选两两之间熔解温度不同的荧光标记探针的同源突变序列作为标签序列组；将所述标签序列组中的标签序列与靶基因特异性引物其中一条连接，获得靶基因带标签的特异性引物；将待检DNA样品、荧光标记探针、不同靶基因带标签和不带标签的特异性引物混合于PCR反应体系中进行混合基因体系PCR扩增反应后，收集熔解曲线的荧光信号，与确定的靶基因的熔解温度Tm值进行比较，若相同，则说明待检DNA样品中存在相应靶基因。所述方法能够高通量检测多种靶基因，时间短，成本低。

技术领域

本发明属于PCR基因检测技术领域，尤其涉及一种高通量检测多种靶基因的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种通过酶促反应完成DNA体外扩增的方法，操作方法简便、检测高效准确且检测成本低。随着基因检测在疾病诊治中的地位愈发重要，在大批量检测需求面前，基因测序技术因其检测周期长、检测成本高难以普及，随着PCR技术逐步成为临床基因检测的常规方法，低成本、高通量、操作简便的PCR新技术的研发就显得尤为紧迫和重要。

近几年，随着多重PCR技术的发展，出现了很多建立在多重PCR技术上的高通量PCR检测方法。依据产物鉴定方式，分为以电泳法、质谱法为代表的开管高通量PCR检测技术，和以芯片法、荧光熔解曲线、高分辨率熔解曲线为代表的闭管高通量PCR检测技术。目前开管高通量检测技术的应用较多，但由于需要开管操作所以存在非常大的产物污染风险，除了PCR仪器外还需要其他产物鉴定设备，如质谱仪、电泳设备等等，增加了实验成本；闭管检测方法中以高通量的高分辨率熔解曲线技术为代表，该方法目前发展较为成熟，但是反应体系要求格外严密，且部分碱基差异时造成高分辨率熔解曲线上的形态差别过小，纵使经验丰富的专业培训的技术人员也不能确保结果判断的准确性，加上该技术仅限于单通道检测，其通量优化受到了很大的限制。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高通量检测多种靶基因的方法，所述方法具有污染风险小、操作简便、成本低、检测时间短、通量高的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种高通量检测多种靶基因的方法，包括以下步骤：

1)设计随机探针序列，并对随机探针序列进行荧光标记获得荧光标记探针；

2)将所述探针序列的反向互补序列进行随机突变，获得探针序列的反向互补序列的突变序列组，将所述突变序列组中的序列与探针序列互补结合获得双链DNA组，筛选所述双链DNA组中两两双链DNA之间具有熔解温度差的双链DNA，突变序列组中的相应序列为反向标签序列组，合成所述反向标签序列组的互补序列为标签序列组；

3)设计靶基因的特异性引物对，所述特异性引物对包括特异性上游引物和特异性下游引物；将所述标签序列组中的一条标签序列与所述特异性引物对中的一条连接，获得带标签序列的特异性引物；

4)将包含步骤3)中所述靶基因的DNA片段、荧光标记探针、所述带标签序列和不带标签的特异性引物、dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液混合进行单基因体系PCR扩增反应后，进行熔解曲线分析，获得靶基因的熔解温度Tm值，作为所述靶基因的标准Tm值；

5)按照步骤3)～4)的方法操作得到多个不同靶基因的标准Tm值，分别为Tm₁、Tm₂、Tm₃……Tm_n；不同靶基因的特异性引物对中的一条连接步骤2)中所述标签序列组中的不同的标签序列；