[发明专利]一种高通量检测多种靶基因的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，包括以下步骤：

1)设计随机探针序列，并对随机探针序列进行荧光标记获得荧光标记探针；

2)将所述探针序列的反向互补序列进行随机突变，获得探针序列的反向互补序列的突变序列组，将所述突变序列组中的序列与探针序列互补结合获得双链DNA组，筛选所述双链DNA组中两两双链DNA之间具有熔解温度差的双链DNA，突变序列组中的相应序列为反向标签序列组，合成所述反向标签序列组的互补序列为标签序列组；

3)设计靶基因的特异性引物对，所述特异性引物对包括特异性上游引物和特异性下游引物；将所述标签序列组中的一条标签序列与所述特异性引物对中的一条连接，获得带标签序列的特异性引物；

4)将包含步骤3)中所述靶基因的DNA片段、荧光标记探针、所述带标签序列和不带标签的特异性引物、dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液混合进行单基因体系PCR扩增反应后，进行熔解曲线分析，获得靶基因的熔解温度Tm值，作为所述靶基因的标准Tm值；

5)按照步骤3)～4)的方法操作得到多个不同靶基因的标准Tm值，分别为Tm₁、Tm₂、Tm₃……Tm_n；不同靶基因的特异性引物连接步骤2)中所述标签序列组中的不同的标签序列；

6)将待检DNA样品、荧光标记探针、各靶基因的带标签和不带标签的特异性引物、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl、PCR反应缓冲液混合进行混合基因体系PCR扩增反应后，进行熔解曲线分析，将所述熔解曲线中的波谷或波峰对应的温度值与步骤5)中各靶基因的标准Tm值进行比较，若熔解曲线中的波谷或波峰对应的温度值与步骤5)中靶基因的标准Tm值相同，则说明待检DNA样品中存在产生所述标准Tm值的靶基因；

所述荧光标记探针的序列为一种或多种；当所述荧光标记探针的序列为多种时，各种荧光标记探针上标记不同的荧光基团；

当所述荧光标记探针的序列为多种时，步骤6)中所述混合基因体系PCR扩增反应后，通过不同的荧光通道收集标记不同荧光基团的荧光标记探针熔解曲线的荧光信号。

2.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，其特征在于，所述靶基因的个数为2～50。

3.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，其特征在于，步骤1)中所述荧光标记探针的荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、NED、TAMRA、Texas Red、ROX、CY3和CY5中的一种。

4.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，其特征在于，步骤2)中所述熔解温度差≥0.8℃。

5.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，其特征在于，步骤4)中单基因体系PCR扩增或步骤6)中混合基因体系PCR扩增程序如下：预变性95℃，10min；变性95℃，10s；退火和延伸60℃，30s；所述变性、退火和延伸步骤进行40个循环。

6.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，其特征在于，步骤4)中单基因体系PCR扩增后收集熔解曲线信号或步骤6)中混合基因体系PCR扩增后收集熔解曲线信号的程序如下：95℃，30s；30℃，4min；以0.1℃/s的温度转化率升温至80℃后，将温度降至40℃。

7.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的高通量检测多种靶基因的方法，其特征在于，步骤6)中混合基因体系PCR扩增以及收集熔解曲线的荧光信号的体系为25μl，包括：PCR缓冲液，2.5μL；50mM MgCl₂ ，1μL；2.5mM 4×dNTPs，0.7μL；5U/μL热启动DNA聚合酶，0.5μL；10μM不同靶基因带标签的特异性引物各0.1μL；10μM不同靶基因的不带标签特异性引物各0.6μL；10μM荧光标记探针各0.4～1.6μL；待检DNA样品，2μL；余量的水。

8.一种高通量检测多种靶基因的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：权利要求1中所述的荧光标记探针，靶基因带标签的特异性引物，靶基因不带标签的特异性引物，dNTP、DNA聚合酶、MgCl₂ 和PCR反应缓冲液。