[发明专利]单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法

说明书

本发明公开了单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法，所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物均包括接头序列、标签序列和特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一探针包含第一通用序列和第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列和第二修饰基团，第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。本发明提供的组合物及检测方法，具备PCR实时分析检测和熔点分析能力，在检测容量上进一步提升，具有较强的检测通用性。

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR检测技术领域，尤其涉及一种单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法。

背景技术

在诸多实时荧光PCR检测技术中，以TaqMan探针技术应用最为广泛，该探针主要基于DNA聚合酶的水解活性来引发探针上的荧光基团和淬灭基团不可逆的分离，进而形成荧光信号的累积。该技术虽然具有较高的检测效率，但是该技术仅能用于DNA/RNA分子实时分析定量，缺乏PCR后熔点分析的能力。因此，TaqMan探针技术应用过程中始终存在检测容量低的问题。

分子信标探针技术实质上是改良的TaqMan探针技术，即一种空间上呈“发夹”结构的TaqMan探针技术。探针中“发夹”结构的存在使得该技术能够应用于PCR后熔点分析。进一步来说，该技术一定程度上解决了PCR的检测容量的问题，但在检测效率和灵敏度不足使得其在实时分析中的应用受限。

相似的，双杂交探针由两条相邻的标记不同荧光基团的探针所组成，主要利用荧光基团间的荧光能量共振转移现象(FRET)来实现荧光信号的检出，该技术同时具备了分子信标探针PCR后熔点分析以及Taqman探针实时定量分析方面的优点。

公开号为CN102321765A的中国发明专利申请，公开了一种新的荧光PCR检测技术，该技术利用单标记探针同时具有引物和检测探针的特性，巧妙借助空间上的“茎环”结构实现荧光信号的可逆淬灭，同时具备了上述三种技术的优点，并且增加了形成“倒置”扩增曲线的反应特性，丰富了分析DNA/RNA分子的检测维度。

然而，以上四种实时荧光PCR检测技术均存在一个共同缺点，即需要针对特定的DNA/RNA分子设计特定探针，进一步来说，缺乏检测通用性，使得检测过程更加复杂，增加检测成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兼备上述四种技术的优点的新型检测工具和检测技术，即具备PCR实时分析检测和熔点分析能力，并能够在检测容量上进一步提升，同时克服现有的实时荧光PCR检测技术缺乏“检测通用性”的缺点的技术。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种基于单标记通用探针与特异性引物的组合物的DNA检测方法，所述方法采用一组单标记通用探针和一组特异性引物构建PCR反应体系；所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物包括接头序列、第一标签序列和第一特异性序列，下游引物包括接头序列、第二标签序列和第二特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一特异性序列、第二特异性序列分别与靶标基因反义链、正义链的一段特异性序列反向互补；

所述第一探针包含第一通用序列，其一端标记有第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列，其一端标记有第二修饰基团，所述第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。

说明性地参照图1，图1中示出了单标记通用探针和特异性引物的结构示意图，其中第一探针1包括第一通用序列2和第一修饰基团3，第二探针4包括第二通用序列5和第二修饰基团6。上游引物7包括接头序列8、第一标签序列9和第一特异性序列10，下游引物11包括接头序列12、第二标签序列13和第二特异性序列14。