[发明专利]单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法

权利要求书

1.基于单标记通用探针与特异性引物的组合物的DNA检测方法，其特征在于：所述方法采用一组单标记通用探针和一组特异性引物构建PCR反应体系；所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物包括接头序列、第一标签序列和第一特异性序列，下游引物包括接头序列、第二标签序列和第二特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一特异性序列、第二特异性序列分别与靶标基因反义链、正义链的一段特异性序列反向互补；

所述第一探针包含第一通用序列，其一端标记有第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列，其一端标记有第二修饰基团，所述第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。

2.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：所述接头序列、第一标签序列、第二标签序列为任意的不与靶标基因杂交的附加核酸序列。

3.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：当所述第一通用序列与第一标签序列互补，所述第一修饰基团标记于第一探针的5′端；当所述第一通用序列与第一标签序列反向互补，所述第一修饰基团标记于第一探针的3′端。

4.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：当所述第二通用序列与第二标签序列相同，所述第二修饰基团标记于第二探针的5′端；当所述第二通用序列与第二标签序列反向，所述第二修饰基团标记于第二探针的3′端。

5.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：所述第一修饰基团和第二修饰基为受体荧光基团或者供体荧光基团。

6.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：所述第一修饰基团和第二修饰基团为荧光基团和淬灭基团。

7.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：所述接头序列的Tm值范围在50-65℃；所述单标记通用探针序列的Tm值范围在50-65℃；

所述第一特异性序列、第二特异性序列、接头序列以及单标记通用探针序列的Tm值相差不超过5℃。

8.如权利要求1-7中任一一项所述的DNA检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：合成所述单标记通用探针、特异性引物；构建PCR反应体系，对待测靶标基因进行PCR扩增；在PCR扩增反应结束后，收集PCR产物的荧光信号以形成相应的扩增曲线，对待测靶标基因进行分析。

9.如权利要求8所述的DNA检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应至少进行三轮扩增；进行第三轮扩增时，二轮扩增的PCR产物经过变性、退火后，其单链自身形成一茎环结构体；

所述单链两端对应所述接头序列的部分杂交，构成该茎环结构体的锁合部；所述单链两端对应所述第一标签序列、第二标签序列的部分构成探针杂交部，该探针杂交部与锁合部相邻；

所述单标记通用探针的第一探针和第二探针分别与探针杂交部上对应的互补序列杂交，第一修饰基团和第二修饰基团靠近。

10.单标记通用探针及特异性引物的组合物，其用于DNA检测中构建PCR反应体系，其特征在于：所述组合物包括一组单标记通用探针和一组特异性引物，所述单标记通用探针和特异性引物为权利要求1-9中任一一项所述的单标记通用探针和特异性引物。