[发明专利]基于上转换荧光的能量共振转移技术用于外泌体的检测

说明书

本发明公开一种基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测，涉及稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的传感器，通过携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链，能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA间的距离拉近到小于10 nm，从而发生荧光共振能量转移，产生荧光信号；该传感器的优点：稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能，具有光化学稳定性，无自体荧光；避免使用蛋白等昂贵的试剂、简化了实验流程；该方法基于荧光能量共振转移原理检测具有高灵敏度。可用于乳腺癌细胞来源外泌体的高灵敏检测。

技术领域

本发明涉及一种基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明之间的荧光共振能量转移原理的分析方法，属于分析化学及纳米技术领域。

本发明涉及以稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的适配体传感器，并通过上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体(exosome)的高灵敏检测，属于传感器领域。

背景技术

外泌体是由多种活细胞分泌的囊泡小体，可以被绝大多数类型的细胞如：B细胞，T细胞，树突细胞，巨噬细胞，神经元，神经胶质细胞，肿瘤细胞和干细胞等分泌产生，直径约为30～100nm。外泌体来源多样并且携带大量的蛋白质、脂质、DNA、RNA等生物信息分子，这使其成为细胞间信息传递或改变的使者。大量与外泌体有关的报道都表明，研究外泌体对生物及医学领域具有重大意义。尤其重要的是，外泌体含有丰富的内容物，是提供癌症诊断、发展、转移等信息的潜在来源。因此，外泌体的分析检测在研究中显得尤为重要。

外泌体定量常用的方法主要是利用动态光散射仪(DLS)、纳米粒子示踪技术(NTA)；外泌体的定性分析主要是依赖其表面蛋白进行的，常用的检测方法有流式细胞术(Flow Cytometry)、蛋白质印迹法(Western Blot)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等。这些方法虽然经典，却有着仪器昂贵、分析耗时、所需样品量大等缺点。因此，开发一种高灵敏度、便捷快速的外泌体检测方法显得尤为重要。

最近，多位学者利用核酸适配体的方法对外泌体进行了检测。核酸适配体是一条可以与配体特异性结合的DNA或RNA单链。Qing等人利用外泌体表面蛋白CD63的适配体研制出一种电化学传感器，对外泌体进行了检测，检测限(LOD)为1×10⁶particles/mL；Xia等人应用纳米材料碳管设计了一种可视化的适配体生物传感器用于外泌体检测，检测限低达5.2×10⁵particles/μL；Chen应用上转换纳米材料设计了一种基于荧光共振能量转移的纸基技术用于外泌体检测，检测限可低至1.1×10³particles/μL。以上技术提供了一种检测外泌体的新思路。

稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能在生物应用中具有较大优势，被广泛应用于生物领域。荧光共振能量转移(LRET)是一种无辐射过程，即处于激发态的能量供体将能量无辐射的转移给能量受体，后者通过荧光发射或其它无辐射方式将能量释放出来。产生荧光共振能量转移的前提是能量供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠且二者的空间距离在10nm之内，因此LRET技术具有灵敏度高、分辨率高、简单方便等优点。UCNPs具有良好的化学稳定性、光稳定性、无自体荧光等优点，是一种较好的进行LRET的能量供体。基于LRET原理，使用UCNPs构建荧光生物传感器用于生物检测或光动力治疗、光学成像等应用正成为研究热点。四甲基罗丹明(TAMRA)是一种可见光区荧光染料，它的荧光激发光谱与NaYF₄:Yb,Er的发射光谱具有较大重叠，且其发射峰位于585nm，恰好与NaYF₄:Yb,Er的发射峰分离，因此在NaYF₄:Yb,Er作为能量供体进行能量共振转移时，TAMRA是一个很好的能量受体。