[发明专利]基于上转换荧光的能量共振转移技术用于外泌体的检测

权利要求书

1.一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器，其特征在于：包括UCNPs、TAMRA 修饰的EpCAM-2和UCNPs修饰的EpCAM-1，所述的EpCAM-1的DNA序列为：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGT-3’, 5’端修饰-COOH；EpCAM-2的碱基序列为： 5’-CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’, 3’ 端修饰TAMRA；

携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链EpCAM-1-UCNPs，EpCAM-2-TAMRA，能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA之间的距离拉近到小于10 nm，从而发生荧光共振能量转移，当在980 nm近红外光激发下，TAMRA会发出黄色荧光，利用585 nm处荧光强弱的变化，能进行溶液中外泌体的定量分析。

2.一种制备如权利要求1所述的用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）稀土掺杂上转换纳米材料的合成：加含量是Y 78%，Yb 20%，Er 2%的稀土硬脂酸盐0.8 mmol，NaF 28 mmol，油酸（OA）12 mL，十八烯（ODE）8 mL于100 mL三颈烧瓶，氩气氛围中回流加热至135℃~145℃，保持30 min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000 rpm离心3 min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，获得油酸包覆的UCNPs；

2）BF₄^-修饰UCNPs：称取10 mg步骤1）制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2 mL环己烷中，加入2 mL NOBF₄的DMF溶液，轻轻摇动10 min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和环己烷混合溶剂共2 mL纯化，离心11000 r/min，5 min，DMF洗一次，沉淀烘干备用；

3）EpCAM-1修饰UCNPs：取1 mg/mL 步骤2）制得的BF₄^--UCNPs的水溶液500 μL，加入至小玻璃瓶中，加入1.5 nmol的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1 mL， UCNPs修饰的EpCAM-1的EpCAM-1-UCNPs最终浓度为1.5 μM，4℃搅拌过夜，8000 r/min超滤离心5 min，沉淀水洗两次，重分散在500 μL纯水中，4℃保存备用；

4 ）5ml的EP管中分别加入5 μL步骤3）制得的浓度为1.5 μM EpCAM-1-UCNPs、0.25 μM的EpCAM-2-TAMRA最后加配比为Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM的Tris盐酸缓冲液配置成100 μL溶液，28℃振荡1 h，检测其荧光强度，即得荧光传感器，用于检测其荧光强度。