[发明专利]DNA甲基化检测方法及相关应用

说明书

本公开提供用于DNA甲基化检测的方法、试剂、试剂盒及相关的应用，进一步提供RNF180基因或Reprimo基因甲基化的检测方法、核酸、试剂盒和应用，所述方法、核酸、试剂盒等可用于癌症诊断和/或预后。

技术领域

本公开属于生物技术领域，涉及体外诊断技术。具体地讲，本公开涉及用于DNA甲基化检测的方法、试剂、试剂盒及相关的应用，涉及用于癌症诊断和/或预后的方法、产品(包括试剂、试剂盒)。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的一类重大疾病。虽然肿瘤的治疗有了长足的进步，但高死亡率仍未得到有效控制。根据国家癌症中心最新一期的全国癌症统计数据(来源于2017年全国肿瘤登记中心收集汇总的全国31省市自治区肿瘤登记处2014年的恶性肿瘤登记资料)显示，全国恶性肿瘤新发病例数380.4万例，标化发病率174.0/10万，略低于世界平均水平182.3/10万。但中国癌症发病约占全球的22％，发病人数全球第一。中国癌症死亡病例超200万，约占全球的27％，标化死亡率122.2/10万，高于世界平均水平102.4/10万。由于缺乏癌症早筛以及就诊时间偏晚等原因，中国癌症的5年生存率仅为30.9％，而发达国家普遍在70％以上。

以胃癌为例，我国每年新增胃癌病例约68万，死亡人数约49.8万；发病人数约占世界年新发病例数的50％。胃癌患者5年生存率与介入时期密切相关，中晚期胃癌5年生存率低于15％，而早期胃癌患者5年生存率超过90％。因此提升胃癌早期诊断和筛查水平，对于控制胃癌人群增长、延长患者生存期和提高生存质量均有重要意义。现阶段，内镜(胃镜)为主的影像学检查广泛应用于临床和体检。结合切片病理分析，胃镜检查可发现早期胃癌黏膜改变，但仍存在IIb型早期胃癌难发现，活检准确取材成功率不稳定导致误诊风险等问题。且胃镜依从性较差，70％的受检人会因其侵入性产生恐惧、紧张和焦虑情绪，所以多数患者，尤其老年人，不愿意接受胃镜检查。而由于操作人员经验不足或设备清洁不当导致的上消化道损伤和交叉感染的情况也时有报道。其它如X射线或CT扫描等影像检查手段多应用于术前评价和手术方案制定，早期诊断意义有限。而蛋白分子标志物，如CEA及CA19-9等的检测，对胃癌特异性较低，通常作为预后监测指标。综上，开发新型胃癌早期诊断技术，实现胃癌早期、灵敏、特异诊断，意义重大。

近年来，研究发现分离自肿瘤患者血浆的DNA中存在基因甲基化水平异常；基因甲基化可能是肿瘤发生、发展的重要分子特征。

环指蛋白180(ring finger protein 180，RNF180)具有抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用，参与胃癌的淋巴转移。近年研究发现RNF180基因的启动子序列内的CpG位点甲基化状态与胃癌发生、病程发展和患者预后之间关系紧密。一些研究提示，RNF180基因甲基化检测可能具有胃癌体外分子诊断的应用价值。

Reprimo是一种糖基化胞浆蛋白，作为p53的下游效应器，引起细胞周期的G2/M期阻滞，具有抑制细胞增殖的作用。据报道，在胃癌中，Reprimo作为抑癌基因，由于启动子区域的异常甲基化状态，其表达在部分样本中缺失。研究提示，Reprimo或其甲基化在胃癌诊断方面可能具有潜在的应用价值。

传统的甲基化检测包括甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性荧光PCR法(methylight)及亚硫酸氢盐测序法。

甲基化特异性PCR(MSP)及甲基化特异性荧光PCR法(methylight)均是通过对样本DNA进行亚硫酸盐处理，在保留甲基化胞嘧啶的同时将非甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶；再分别通过甲基化/非甲基化特异性的引物来进行PCR配合琼脂胶电泳后显影或使用荧光PCR发光法来检测样本DNA中的甲基化程度。

亚硫酸盐测序同样先对样本DNA进行亚硫酸盐处理并用通用引物(不含有CpG岛，因此可用同时扩增甲基化模板及非甲基化模板)进行PCR扩增；再将扩增产物进行测序，根据甲基化序列与非甲基化序列的差异来识别样本DNA中的甲基化位点及程度。