[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明应用基因工程方法，敲除基因zwf、malE，替换谷氨酸棒杆菌基因icd_Cg为变形链球菌Streptococcus mutans JH 1005中基因icd_Sm，达到重组菌胞内NADPH水平精确调控的目的。重组菌经LBG液体培养基摇瓶实验，重组菌胞内NADH含量由出发菌的1.97μmol(g DCW)^‑1增加到2.73μmol(g DCW)^‑1，胞内NADPH含量降低至0.15μmol(g DCW)^‑1，明显低于出发菌胞内NADPH含量1.43μmol(g DCW)^‑1。此发明成功阻断了谷氨酸棒杆菌中NADPH合成的相关途径，为构建可精确调控胞内NADPH水平的菌株提供崭新的思路。

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)又称为还原型辅酶Ⅱ，在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用，具有重要的生物学意义。它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，NADPH在细胞内分布广泛，通过参与800多个氧化还原反应来调节细胞内氧化还原水平并影响着众多基因表达、细胞功能、代谢途径和物质跨膜运输，参与多种合成代谢反应，如参与合成代谢，如氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成均需NADPH提供还原力，对细胞正常生长和代谢有重要影响NADPH是NADP⁺的还原形式。并且是微生物代谢网络中含量最丰富的氧化还原辅酶之一。

微生物细胞内NADPH主要通过中心碳代谢途径合成。其中，磷酸戊糖途径的不可逆氧化阶段是NADPH的主要来源。依赖NADP⁺的6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶在氧化生成1mol 6-磷酸葡萄糖酸和氧化脱羧生成1mol 5-磷酸核酮糖过程中，分别产生1mol NADPH。微生物胞内NADPH的消耗主要通过同化作用。同化作用利用中心碳代谢途径的中间代谢物，合成75～100个细胞原件、辅酶以及辅基，维持细胞正常生长代谢。此过程需消耗大量ATP和NADPH，如合成1g大肠杆菌干细胞需消耗41mol ATP和18mol NADPH。由此可见，胞内NADPH的生成和消耗同胞内很多重要的代谢途径相关联，维持细胞内辅酶的平衡对于细胞生长、代谢以及产物的合成都非常关键。为了维持细胞正常生长和代谢，必须精确调控细胞内NADPH的供应与需求。

NADPH对C.glutamicum lysC^fbr合成L-赖氨酸非常重要，合成1mol L-赖氨酸需要消耗4mol NADPH。在L-赖氨酸生物合成途径中有四个反应涉及NADPH的消耗。谷氨酸棒杆菌中NADPH的代谢调控机制在不同的生理条件下通过¹³C代谢流分析得以阐明，这为建立NADPH平衡具有重要作用。在谷氨酸棒杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、苹果酸酶和异柠檬酸脱氢酶以NADP⁺为辅因子，参与NADPH合成，这些NADPH不仅要满足L-赖氨酸合成需求而且还要用于菌体生长。因为，增加1g菌体需要消耗16.4mmol NADPH。谷氨酸棒杆菌中NADPH的代谢是非常灵活的，它的消耗与合成很大程度上取决于菌体生长状态、碳源的供应以及菌体的遗传背景。目前许多基于NADPH供给的调控策略无法调控和优化胞内NADPH与中心碳代谢的特异性，为满足L-赖氨酸高效合成时对NADPH的需求，理论上提高NADPH的供给水平可显著增加L-赖氨酸产量。但一味强调提高辅因子NADPH的合成量，不仅不利于L-赖氨酸的大量积累，还阻碍了菌体对糖的利用和降低菌体量，辅因子NADPH水平与胞内微环境、代谢网络和目标代谢产物合成之间的关系还不明确。

发明内容