[发明专利]肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法

说明书

本发明涉及一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法，所述方法，包括以下步骤：将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基培养、离心收集沉淀、渗透胁迫得到粗酶液，对粗酶液进行一次CS(Cellufine Sulfate)柱纯化层析，即可得到高纯度的肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ，本发明具有工艺简单、易放大，设备需求少，试剂成本低等特点，制备的肝素酶I比活达135IU/mg，纯酶活性收率高达57％，与已有方法相比，纯化收率增加将近一倍。

技术领域

本发明涉及一种肝素酶Ⅰ的制备方法，尤其涉及一种使用渗透胁迫产生粗酶，并经一步CS层析纯化制备肝素酶Ⅰ的方法。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。

已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、II、III，这三种酶的酶学特性各不相同。在肝素黄杆菌纯化出的三种肝素酶中，只有肝素酶II的结构被解析，它的底物特异性也最差；肝素酶I则最适用于低分子量肝素的制备。

肝素酶Ⅰ是一种分子量大约43kd的单体蛋白质，其等电点为9.0，可能是现有肝素酶中裂解肝素能力最强的酶，目前被大量用于凝血弹力图检测仪配用耗材肝素酶杯中。

肝素酶Ⅰ的制备工作有许多研究报道，但已报道的制备工艺大都存在工艺复杂、收率低等缺点。

Yang等人(J Biol Chem，1985，260(3)：1849-1857)用羟基磷灰石处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，首先制得纯酶，活性收率大约1％；

Daniel等人(J Bio Chem，1992，267(34)：24347-24355)用羟基磷灰石处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石HPLC、Mono-SFPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯酶，活性回收率10.8％；

马小来等(食品与药品，2005，32(5)：446-450)使用羟基磷灰石处理、DEAE-Sepharose柱层析、CM-Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到酶，活性收率13.4％；

Xiaolai Ma等(J Chrom B，2006，843(2)：209-215)通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose柱层析、CM-650柱层析、SP-650柱层析、sephadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯酶，收率达17.8％；

中国专利CN200910039360-一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法，公开了一种工艺，通过对粗酶液进行连续三次洗脱条件各不相同的SP-Sepharose FF层析，纯化得到高纯度的酶，获得高达30％的活性收率，为已报道的最高收率制备纯化技术。

绝大多数肝素酶制备工艺中粗酶从细胞中的释放采用超声破碎法，该法需要特殊设备，处理效率低，而且制得的粗酶含有的杂蛋白较多导致纯化步骤复杂。

Zimmermann等(Appl Biochem Biotechnol.1991 Aug；30(2):137-48.)通过渗透胁迫法使得肝素酶从菌体内部释放出来，可免于使用超声破碎仪。

本发明在借鉴使用渗透压胁迫法制备粗酶时，采用了新的工艺，降低了粗酶中的杂蛋白含量，粗酶从细胞中的释放处理效率大为提高，本发明进一步对粗酶进行纯化,发现使用CS柱层析可容易的获得高纯度的酶。而现有技术中使用CS柱层析则需要复杂的层析过程。

发明内容

本发明提供一种新的肝素酶Ⅰ的制备方法，可快速有效地通过一次柱层析即获得高纯度酶，进一步提高肝素酶Ⅰ的纯酶活性收率。

本发明包括下述顺序的步骤：