[发明专利]肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的高效制备方法在审
| 申请号： | 201811071827.6 | 申请日： | 2018-09-14 |
| 公开（公告）号： | CN109182321A | 公开（公告）日： | 2019-01-11 |
| 发明（设计）人： | 马小来;郭进京;陈冀中 | 申请（专利权）人： | 深圳市长征生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/88 | 分类号： | C12N9/88;C12R1/20 |
| 代理公司： | 北京华科联合专利事务所(普通合伙) 11130 | 代理人： | 王为;孟旭 |
| 地址： | 518131 广东省深圳市龙华*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 黄杆菌 肝素 肝素酶 高效制备 粗酶液 离心收集沉淀 发酵培养基 种子培养基 活性收率 设备需求 渗透胁迫 试剂成本 肝素酶I 高纯度 柱纯化 比活 层析 纯酶 收率 制备 放大 | ||
1.一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的制备方法，所述方法包括下述步骤：
(1)肝素黄杆菌的发酵制备：将肝素黄杆菌从平板或斜面上接到种子培养基中培养1天，再接入二级种子培养基培养1天，然后接入发酵培养基，培养1-2天，离心收集沉淀，为含酶的菌体细胞；
(2)渗透胁迫法制备粗酶液：将含酶的菌体细胞悬浮在蔗糖溶液中0.5-24小时，离心，取沉淀悬浮于Tris-HCl缓冲液(含CaCl2及NaCl、pH6.5-8.0)中，冰浴中渗透胁迫提取0.5-5小时，离心收集清液，将沉淀再如前渗透胁迫提取一次，合并二次提取液，即为粗酶液；
(3)肝素酶Ⅰ的CS柱纯化：步骤(2)得到的粗酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡冲洗，再以梯度浓度线性上升的缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱3-6个柱体积，收集有酶活性的含0.35-0.5M氯化钠缓冲液洗脱各管，合并，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到纯化的肝素酶Ⅰ。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)渗透压胁迫法所用蔗糖溶液为10-40％(m/v)，优选30-40％；所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-50mM，优选10-20mM；Tris-HCl缓冲液含0.1-10mM CaCl2，优选浓度为1-5mM；Tris-HCl缓冲液含50-250mM NaCl，优选浓度为100-200mM；Tris-HCl缓冲液pH6.5-8.0，优选pH7.0-7.5)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所用Tris-HCl缓冲液浓度为5-150mM，优选10-100mM；其pH在6.5-8.0之间，优选pH7.0-7.5；Tris-HCl缓冲液含0.1-20mMCaCl2，优选浓度为1-10mM。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)所用CS层析柱的填料优选使用CHISSO公司的亲和层析填料Cellufine Sulfate，也可使用其它同类亲和填料。
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