[发明专利]CDH1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法

说明书

CDH1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法基于焦磷酸测序技术。其中包括特异性扩增引物如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示，特异性焦磷酸测序引物如SEQ NO.3所示，以及PCR反应试剂、焦磷酸测序相关试剂。本发明可进行快速定量检测，具有特异性高、检测周期短、准确性高等优点。检测结果有助于在分子水平上进行相关肿瘤的筛查，具有临床意义与重要价值。

技术领域：

本发明属于生命科学和生物技术领域，是一种基于焦磷酸测序技术的CDH1基因甲基化水平检测的试剂及应用。

背景技术：

肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene，TSG)是生命体调控自身细胞增殖、分化和凋亡过程中的重要复性调节因子之一。当抑癌基因启动子发生高甲基化则引起基因失活从而助于细胞的无限制生长，这一机制存进了肿瘤的形成。因此，对于抑癌因子的相关研究则有助于解释细胞增殖、分化以及癌变等过程。通常在癌症早期就可以检测出抑癌因子的异常甲基化，并通过对癌症相关基因甲基化谱进行筛选，可作为肿瘤的早期诊断、治疗和预后提供理论及实验依据。而研究表明肿瘤抑制基因CDH1基因启动子甲基化水平与特发性肺纤维化、乳腺癌、宫颈癌、胃癌等常见肿瘤具有较高相关性。因而寻求简单、安全、准确、高效的筛选工具，对于癌症防治、降低死亡率具有重大的科学意义。

目前检测CDH1启动子甲基化水平的方法主要包括甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化敏感性高分辨率溶解曲线(MS-HRM)、亚硫酸盐测序PCR(BSP)、荧光定量法。目前使用PCR扩增检测来判断样品是否存在甲基化的MSP法得到了普遍的应用。但其存在着不能定量检测以及高假阳性风险的局限性；而通过PCR联合sanger测序技术来检测甲基化水平的BSP法，则受限与其繁琐的操作而不适合大批量测序。且其检测结果受克隆挑选的数目所影响，而只是一种半定量检测方法。

本发明采用准确性高、检测周期短并且检测通量高的PCR联合焦磷酸检测技术。焦磷酸测序技术的原理是：在引物与模板DNA退火之后，通过DNA polymerase、ATP硫酸酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双膦酸酶的协同催化，进而偶联了引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放。因而通过检测荧光的释放及强度即可达到实时测定DNA序列的目的。因此检测过程中单个检测位点的C、T荧光信号强度确切的反映该位点的甲基化状态，进而得到更加直观的检测结果。正因为这一原理，使得焦磷酸测序技术不仅可以进行定性检测，更能实现甲基化水平的定量分析。与此同时，在实现高准确性检测的基础上还具有可以在相对较短时间内实现多样品批量检测，具备检测通量高、检测周期较短等优势。

因此，本发明在保证高检测出率、短检测周期、高通量、高准确度以及低污染风险的基础上，得出有助于遇见相关肿瘤的早期的可靠结果。

发明内容

本发明提出了基于焦磷酸测序技术，用于检测CDH1基因启动子CPG岛甲基化水平的试剂盒，包括dNTPs，缓冲液，热启动DNA聚合酶(Hotstart Taq)，ddH₂O，特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2，以及测序引物SEQ NO3。其碱基序列依次如下：

SEQ NO1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’

SEQ NO2：5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’

SEQ NO3：5’-GTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAG-3’

其中SEQ NO1在其5’端具有生物素标记。

检测CDH1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括：

一.样本中DNA的提取；

二.对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，处理方式为180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μg DNA的20μl水溶液混合然后98℃，10min，然后64℃，2.5个小时；