[发明专利]CDH1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法在审
| 申请号： | 201811064477.0 | 申请日： | 2018-09-12 |
| 公开（公告）号： | CN109136375A | 公开（公告）日： | 2019-01-04 |
| 发明（设计）人： | 黄映辉;张霖;马羚 | 申请（专利权）人： | 黄映辉 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京思海天达知识产权代理有限公司 11203 | 代理人： | 刘萍 |
| 地址： | 100124 北京*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 甲基化水平 焦磷酸测序 检测引物 启动子区 焦磷酸测序引物 特异性扩增引物 分子水平 检测结果 快速定量 临床意义 检测 筛查 肿瘤 | ||
1.CDH1基因启动子区的甲基化水平检测引物，其特征在于，引物序列包括：
上游扩增引物SEQ NO.1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’；
下游扩增引物
SEQ NO.2:5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’
焦磷酸检测引物SEQ NO.3:5’-GTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAG-3’.
其中SEQ NO.1的5’端进行生物素标记。
2.检测CDH1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括：
一.样本中DNA的提取；
二.对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，处理方式为180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μg DNA的20μl水溶液混合然后98℃，10min，然后64℃，2.5个小时；
三.
以步骤二中的产物作为模板以上游扩增引物SEQ NO.1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’；下游扩增引物
SEQ NO.2:5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’进行PCR扩增；
四.将上一步的PCR产物置于焦磷酸测序仪中进行测序；
五.根据PyroMark软件输出检测报告得出样本中CDH1启动子甲基化水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的扩增条件为预变性95℃15min；94℃30s,60℃30s，72℃，47个循环，72℃10min；
根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功，并根据100bp标记条带之下是否有条带来判断是否有引物二聚体；
对于扩增成功且无明显引物二聚体的样品，将剩余扩增产物进行焦磷酸测序，所用测序引物如权利要求1所述的SEQ NO.3。
4.用于检测CDH1基因chr16：68737132位点CPG甲基化水平的试剂盒，其特征在于，包括250units热启动DNA聚合酶、200μl浓度为10mM dNTPs、2ml缓冲溶液、1.5ml ddH2O、1ml浓度为15mM的MgCl2，特异性扩增引物SEQ NO1，SEQ NO2以及特异性焦磷酸检测引物SEQ NO3一种或多种。
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