[发明专利]用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

说明书

本发明公开了一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。其中，引物组合物包括正向外引物Mg‑F3，反向外引物Mg‑B3，正向内引物Mg‑FIP‑Biotin，反向内引物Mg‑BIP和特异性探针Mg‑HP‑FITC。试剂盒包括上述引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液、检测缓冲液和横向流动试纸条。试剂盒可应用于水稻根以及水稻田土壤中拟禾本科根结线虫的快速诊断和鉴别，具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便快捷、结果可视化等优点，可应用于实际生产中的现场检测以及基层农技人员使用操作，对水稻根结线虫病的早期预警和防控具有极其重要意义。

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，尤其涉及一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。

背景技术

植物寄生线虫是水稻生产上的重要病原物，其中危害最为严重的是拟禾本科根结线虫（Meloidogynegraminicola）。该线虫是水稻上重要的内寄生线虫，广泛分布于南亚、东南亚、非洲、美洲和欧洲等国家的水稻产区，引起水稻根结线虫病（Rice Root-KnotDisease），通常造成水稻减产11%至80%（Mantelin et al.，2017），甚至达100%，严重影响水稻的稳定生产。近年来，随着国内耕作模式的改变，特别是直播水稻田面积的逐年增加，由拟禾本科根结线虫引起的水稻根结线虫病发生危害也越来越严重。2016年至2018年，我国湖南、湖北、江西、江苏、海南、广西等多地水稻根结线虫病发生严重，引起水稻大面积减产。拟禾本科根结线虫寄主范围广，危害隐蔽，防治极其困难。目前常用的低毒杀线虫剂大多用于旱地作物其他种类线虫的防治，而直接用于水田根结线虫病害防控的安全有效、低成本的防治措施非常有限，特别是作物定植之后再进行水稻根结线虫病害防治尤其困难。所以，开展水稻根及其水田土壤样品中拟禾本科根结线虫病原快速、准确的检测鉴定，对水稻根结线虫病的早期预警和实施有效的防控具有极其重要的意义。

目前，拟禾本科根结线虫病原鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子生物学鉴定。虽然PCR方法在一定程度上克服了传统形态学鉴定上的缺陷，但需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等较昂贵的仪器设备、较高的检测费用和较复杂的操作步骤。另外，这两种方法，都需要将线虫从待检测的土壤样品中进行分离和在显微镜下进行初步的形态学观察及挑取线虫等过程，既费时费力，又需要操作人员具备专业的技能和丰富的经验，不能满足快速检测的需要，不利于现场快速检测以及基层普及应用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等开发的一种新型恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温60～65℃条件下保温30～90 min，即可实现核酸的大量扩增。扩增产物检测可通过肉眼观察反应过程中产生的焦磷酸镁白色浑浊沉淀或是通过向其扩增产物中加入荧光染料等，利用颜色变化来直接判定结果。由于LAMP不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高、产物易检测、成本低等优点，已广泛应用于病毒、细菌、真菌、寄生虫等方面的检测。但目前还没有通过直接提取土壤中拟禾本科根结线虫的DNA而快速检测水稻田拟禾本科根结线虫的LAMP方法。

虽然LAMP技术在检测动植物病原物上表现出了极大的优势而被多个领域应用，但是该技术在结果呈现方面仍然表现出一定不足和缺陷。其主要是利用焦磷酸镁白色浑浊沉淀或是荧光染料显色时有可能会因显色不明显而造成肉眼观察不便捷或误判等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。试剂盒用于拟禾本科根结线虫的LAMP-LFD检测，特异性强，灵敏度高，可应用于检测拟禾本科根结线虫，总DNA提取简便快速，直接提取土壤DNA进行快速检测，设备简单，耗时短。