[发明专利]用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，由其组成的试剂盒及试剂盒的应用

权利要求书

1.一种用于检测拟禾本科根结线虫的引物组合物，其特征在于，包括正向外引物Mg-F3，反向外引物Mg-B3，正向内引物Mg-FIP-Biotin，反向内引物Mg-BIP和特异性探针Mg-HP-FITC；所述正向外引物Mg-F3的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列，所述反向外引物Mg-B3的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，所述正向内引物Mg-FIP-Biotin的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的DNA序列，所述反向内引物Mg-BIP的DNA序列为SEQ ID NO.5所示的DNA序列，所述探针Mg-HP-FITC的DNA序列为SEQ ID NO.6所示的DNA序列。

2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合物、dNTPs、DNA聚合酶、反应缓冲液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中，所正向述外引物Mg-F3和所述反向外引物Mg-B3的浓度均为0.2 μM，所述正向内引物Mg-FIP-Biotin和所述反向内引物Mg-BIP的浓度均为1.6 μM；所述特异性探针Mg-HP-FITC浓度为20 pM；

和/或，所述dNTPs的浓度为1.2 mM；

和/或，所述DNA聚合酶的浓度为8 U。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括20 mM Tris-HCl、10 mM KCl、10 mM（NH₄）SO₄、6 mM MgSO₄和0.1wt % Triton X-100。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测缓冲液和横向流动试纸条。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测缓冲液包括137 mM NaCl、2.7mM KCl、4.0 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄和0.1wt % Tween 20，pH 7.4。

7.一种权利要求2至6中任一项所述试剂盒在检测水稻根或根围土壤中拟禾本科根结线虫中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：

（1）提取待检土壤或水稻根样品的DNA；

（2）以提取的土壤或水稻根DNA为模板，利用所述的试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物；

（3）检测所述扩增产物中是否含有拟禾本科根结线虫。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于， 所述LAMP扩增反应条件具体为：在60～65℃温育30～90 min，然后82℃保温5 min终止反应。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述（3）步骤中检测方法为：将LAMP扩增产物加入终浓度为20 pM的探针Mg-HP-FITC进行杂交，63℃温育5 min得到杂交液，将所述杂交液与所述检测缓冲液以1:9的体积比混匀得到混合液，将横向流动试纸条垂直浸入所述混合液中进行显色反应，试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，表明检测样品中含有拟禾本科根结线虫；试纸条只有质控线出现条带，则检测结果为阴性，表明检测样品中不含有拟禾本科根结线虫；若只有检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。