[发明专利]对小鼠耳蜗神经元和毛细胞进行病理分析的体视学方法

说明书

本发明公开了一种对小鼠耳蜗神经元和毛细胞进行病理分析的体视学方法，包括如下步骤：对小鼠耳蜗组织进行切片，并对切片做化学成分特异染色；在每一张切片上相同部位获取照片，经显微摄像系统输入计算机；依照体视框的计数原则计数神经元的和毛细胞的数目；用体视学软件对耳蜗神经元和毛细胞损伤丢失和所处频率位置进行定量分析，采用体视学方法计数，达到小鼠耳蜗神经元和毛细胞数目。本发明借助计算机及数据处理系统和显微镜及显微成像系统，将二维平面经过成像及通过计算机分析处理得到三维形态，更准确的对小鼠耳蜗神经元和毛细胞进行定量和形态结构分析，确保实验结果能真实反映小鼠耳蜗神经元和毛细胞数目。

技术领域

本发明涉及基础医学实验技术领域，具体为一种对小鼠耳蜗神经元和毛细胞进行病理分析的体视学方法。

背景技术

传统的小鼠耳蜗神经元和毛细胞形态研究方法容易使人们对组织结构的认识局限在二维空间，并且缺乏组织结构的数量概念。随着计算机的普及、图像分析仪的产生和体视学原理和方法的发展，应用体视学方法能使人们从三维水平定量地阐明组织、细胞结构。

目前对小鼠耳蜗神经元和毛细胞的测定和分析均采用连续的组织薄切片和三维构建来实现，但是这种方法获得的完整细胞形态与其化学成分含量的速度慢，所需一起价格昂贵，不能对大批量耳蜗神经元化学成分含量进行迅速准确的检测和分析，对于获得完整的小鼠耳蜗神经元细胞信息的三维测量和分析手段不足。

体视学的发展为在组织原位测量单个细胞体积奠定了基础。将组织化学技术和体视学方法相结合，定量对比研究小鼠耳蜗神经元和毛细胞的比例分析，可以对耳蜗病理生理机制防治提供理疗依据。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种对小鼠耳蜗神经元和毛细胞进行病理分析的体视学方法。

根据本发明的目的，提供一种对小鼠耳蜗神经元和毛细胞进行病理分析的体视学方法，包括如下步骤：

(1)取材：收集小鼠耳蜗组织，对小鼠耳蜗组织进行切片，切取成若干连续切片，并对切片做化学成分特异染色；

(2)图像拍摄：每张切片在40倍物镜下的病理区域随机捕获3～5视野，在再100倍物镜下清晰聚焦后等距随机选择视野拍照，在每一张切片上相同部位获取照片，经显微摄像系统输入计算机，相邻的两个组织切片构成一个体视框，前一张作为对照平面，后一张作为测试平面，两者之间高度为8μm；

(3)神经元数目和毛细胞数目计算：在对照平面和测试平面一个视野的固定位置叠放无偏计数框，依照体视框的计数原则计数神经元的和毛细胞的数目。

(4)定量分析：用体视学软件对耳蜗神经元和毛细胞损伤丢失和所处频率位置进行定量分析，采用体视学方法计数，达到小鼠耳蜗神经元和毛细胞数目。

进一步地，所述切片的厚度为3～5μm。

进一步地，体视学设备包括一台显微镜，所述显微镜上装置有能够控制镜下的视野在X轴和Y轴精确移动的控制器，连接到电脑显示器的摄像仪，能够精确测量聚焦深度的指针测微器和能够完成精确技术的物镜。

进一步地，神经元数目的计算公式为：

N(total)＝∑Q-×1/ssf×1/asf×1/tsf

∑Q-代表所测区域运算体视框最后计数的神经元总数；

ssf-为切片抽样分数；

asf-所测区域神经元的面积抽样分数；

tsf-为所测区域神经元的厚度抽样分数。

进一步地，所述切片包括组织截面区域分析切片、组织细胞量化分析切片。