[发明专利]一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒

说明书

本发明公开了一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；微孔板包括多个微孔；微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起；微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。本发明的试剂盒重复性和灵敏度均高，特异性较好，且操作方便，快捷，无需电泳进行检测RT‑PCR结果。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，尤其涉及一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒。

背景技术

甲型流感病毒为常见流感病毒，非常容易发生变异，因此有很多甲型流感病毒亚型。这些亚型则被人们称为“禽流感”。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。因此非常有必要对甲型流感病毒亚型H1N1、H5N1、H7N9进行检测。目前对于这几种亚型上没有很好的检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能快速、高效检测甲型流感病毒亚型中的H1N1、H5N1、H7N9的试剂盒。

具体方案是：一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；所述微孔板包括多个微孔；所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起；所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；

所述磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；所述连接分子为-NH₂-(CH₂)n-，n＝4-8；所述核心引物的序列如SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.3所示；所述5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4到SEQ ID NO.6所示；其中，SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQ ID NO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQ ID NO.2所示的序列和SEQ ID NO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQ ID NO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQ ID NO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。

进一步地，所述微孔的孔壁突出于所述微孔与相邻所述微孔之间的第一连接区域以及所述微孔与所述微孔板侧壁之间的第二连接区域。该结构增加了微孔壁的弹性，使得微孔的孔径能在本领域技术人员知悉的范围内发生微小的变化，从而有利于盖紧。即有利于微孔与微孔板盖上的环形凸起伸入微孔板的微孔时，微孔的孔径适应性地撑大，以便盖紧；当环形凸起离开微孔时，微孔的孔径又能适应性地回原。

进步一地，还包括辅助引物；所述辅助引物的序列如SEQ ID NO.7到SEQ ID NO.9所示，其中SEQ ID NO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQ ID NO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQ ID NO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。辅助引物可在扩增初期与荧光标记的反向引物先预扩增出一些DNA片段，以便于连接在磁珠上的正向引物更容易与预扩增的DNA片段退火结合，提高磁珠参与的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的效率，提高检测的灵敏度。