[发明专利]一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒，包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、核酸提取用磁珠、连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物；微孔板包括多个微孔；微孔的孔壁突出于微孔与相邻微孔之间的第一连接区域以及微孔与微孔板侧壁之间的第二连接区域；微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起；微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。本发明的试剂盒灵敏度和特异性均高，且操作方便，快捷，无需电泳进行检测PCR结果。

技术领域

本发明涉及药品制剂检控领域，尤其涉及一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒。

背景技术

药品生产涉及将药材作为原料进行配制加工，而药品往往又可以成为培养微生物的培养基或培养液。药品存在注射剂、片剂、胶囊等多种剂型，涉及较多的生产环节，且生产区域所需范围较大，物料流转路线较长，从而物料被微生物污染的概率较大，有的甚至会污染到致病菌，造成产品的微生物项目检查不符合《中国药典》的规定，轻者造成药品质量不合格，重者威胁到患者的生命。细菌污染处于药品微生物污染的首位，其中大肠杆菌是一种常见的环境微生物。检测和控制药品制剂中的大肠杆菌有无十分重要。

对于大多数制剂，1克或1毫升不得检出大肠杆菌。对检测技术的灵敏度和特异性要求较高。比浊法等传统检测方法难以满足要求。PCR(聚合酶链式反应)可以将微量的DNA进行大幅的提升，但是其结果检测往往需要转板或跑电泳。在批次药品制剂高通量检测过程中，每增加一个环节就会带来许多重复操作，带来极大不便。

多种常见的传统微孔板包括开放式孔按8×12矩形阵列排列的96孔板，微孔数量更多的有16×24矩形阵列排列的384孔板和32×48矩形阵列排列的1536孔板。大量的微孔虽然满足了高通量检测的目的，由于每个微孔的容量非常小，难以实现物质的有效混合和分离。

基因芯片虽然可以快速地、高通量地检测到相关基因，从而判断出是否带有某种微生物，但是往往是先进行PCR，然后再将PCR产物加入基因芯片中来完成测定。而且基因芯片的价格非常昂贵。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒。

其具体方案是：一种用于药品制剂中控的大肠杆菌检测试剂盒，包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、核酸提取用磁珠、连接有大肠杆菌pyrH正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物；微孔板包括多个微孔；微孔的孔壁突出于微孔与相邻微孔之间的第一连接区域以及微孔与微孔板侧壁之间的第二连接区域；微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起；微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。

进一步地，核酸提取用磁珠为表面包被二氧化硅的纳米磁珠。

进一步地，大肠杆菌pyrH正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；连接分子为-NH₂-(CH₂)n-(T)m-，n＝4-8，m＝10-18；核心引物的序列如SEQ ID NO.1所示；5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；荧光标记为Cy3或Cy5。

进一步地，还包括编号为CMCC44102的大肠杆菌。用于作为阳性对照。

进一步地，还包括辅助引物、PCR缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶；辅助引物的序列包含在大肠杆菌pyrH正向引物的序列中。辅助引物可在扩增初期与5’端带荧光标记的大肠杆菌pyrH反向引物先预扩增出一些DNA片段，以便于连接在磁珠上的正向引物更容易与预扩增的DNA片段退火结合，提高磁珠参与的PCR的效率，提高检测的灵敏度。