[发明专利]一种甲型流感病毒亚型分型检测方法

说明书

本发明公开了一种甲型流感病毒亚型分型检测方法，包括以下步骤：步骤一、设计与合成引物；步骤二、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠；步骤三、甲型流感病毒RNA提取；步骤四、RT‑PCR；步骤五、磁吸附与洗涤；步骤六、检测。本发明的甲型流感病毒亚型分型检测方法，能够高通量、快速、灵敏、特异性对甲型流感病毒亚型进行分型，具有很好的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，尤其涉及一种甲型流感病毒亚型分型检测方法。

背景技术

甲型流感病毒为常见流感病毒，非常容易发生变异，因此有很多甲型流感病毒亚型。这些亚型则被人们称为“禽流感”。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。因此非常有必要对甲型流感病毒亚型H1N1、H5N1、H7N9进行检测。目前对于这几种亚型上没有很好的检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能快速、灵敏地检测甲型流感病毒亚型的方法。

具体方案是：一种甲型流感病毒亚型分型检测方法，包括以下步骤：

步骤一、设计与合成引物：根据甲型流感病毒各亚型的特异性的基因序列，分别设计出对应的正向引物和反向引物；在正向引物的5’端连接上-NH₂-(CH₂)_n-T_m得到磁珠连接正向引物，n＝4～8，m＝14～18；在反向引物的5’端带上荧光标记得到5’端带荧光标记的反向引物，针对不同的甲型流感病毒亚型选择不同的荧光标记；合成甲型流感病毒各亚型的正向引物、磁珠连接正向引物和5’端带荧光标记的反向引物；

步骤二、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠：将步骤一得到的甲型流感病毒各亚型的磁珠连接正向引物分别与羧基磁珠连接，得到甲型流感病毒各亚型的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠；

步骤三、甲型流感病毒RNA提取；

步骤四、RT-PCR：以步骤一得到的甲型流感病毒各亚型的正向引物、5’端带荧光标记的反向引物和步骤二得到的甲型流感病毒各亚型的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠为引物，以步骤三得到的甲型流感病毒RNA为模板，进行RT-PCR反应；

步骤五、磁吸附与洗涤：RT-PCR反应结束后，在磁性作用下，磁珠被吸附聚集，用洗涤液洗涤磁珠，去掉未与磁珠连接的荧光标记；

步骤六、检测：采用酶标仪或者流式细胞仪检测步骤五得到的磁珠上的荧光标记信号，从而确定甲型流感病毒的亚型。

进一步地，步骤四中加入了针对甲型流感病毒各亚型的阳性对照模板；阳性对照模板为带有步骤四中RT-PCR扩增DNA片段的质粒。

进一步地，甲型流感病毒亚型包括甲型流感病毒H1N1亚型、甲型流感病毒H5N1亚型和甲型流感病毒H7N9亚型。

进一步地，H1N1亚型正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示；H5N1亚型正向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；H7N9亚型正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示；H1N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；H5N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示；H7N9亚型5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示。