[发明专利]一种甲型流感病毒亚型分型检测方法

权利要求书

1.一种甲型流感病毒亚型分型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、设计与合成引物：根据甲型流感病毒各亚型的特异性的基因序列，分别设计出对应的正向引物和反向引物；在所述正向引物的5’端连接上-NH₂-(CH₂)_n-T_m得到磁珠连接正向引物，n=6，m=16；在所述反向引物的5’端带上荧光标记得到5’端带荧光标记的反向引物，针对不同的甲型流感病毒亚型选择不同的荧光标记；合成甲型流感病毒各亚型的所述正向引物、所述磁珠连接正向引物和所述5’端带荧光标记的反向引物；

步骤二、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠：将所述步骤一得到的甲型流感病毒各亚型的磁珠连接正向引物分别与羧基磁珠连接，得到甲型流感病毒各亚型的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠；

步骤三、甲型流感病毒RNA提取；

步骤四、RT-PCR：以所述步骤一得到的甲型流感病毒各亚型的所述正向引物、所述5’端带荧光标记的反向引物和所述步骤二得到的甲型流感病毒各亚型的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠为引物，以所述步骤三得到的甲型流感病毒RNA为模板，进行RT-PCR反应；所述步骤四中甲型流感病毒各亚型的所述5’端带荧光标记的反向引物的物质的量与甲型流感病毒各亚型的所述正向引物的物质的量之比为10~20: 1；

步骤五、磁吸附与洗涤：RT-PCR反应结束后，在磁性作用下，磁珠被吸附聚集，用洗涤液洗涤磁珠，去掉未与磁珠连接的荧光标记；

步骤六、检测：采用酶标仪或者流式细胞仪检测所述步骤五得到的磁珠上的荧光标记信号，从而确定甲型流感病毒的亚型；

所述步骤四中加入了针对甲型流感病毒各亚型的阳性对照模板；所述阳性对照模板为带有所述步骤四中RT-PCR扩增DNA片段的质粒；

所述甲型流感病毒亚型包括甲型流感病毒H1N1亚型、甲型流感病毒H5N1亚型和甲型流感病毒H7N9亚型；H1N1亚型正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示；H5N1亚型正向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；H7N9亚型正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示；H1N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；H5N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示；H7N9亚型5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示；

H1N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.10所示的DNA序列的质粒；H5N1亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.11所示的DNA序列的质粒；H7N9亚型阳性对照模板为带有如SEQ ID NO.12所示的DNA序列的质粒；所述步骤四中加入了阴性对照模板；所述阴性对照模板为无RNase的水；

所述步骤五具体为：RT-PCR反应结束后，将PCR管立于第一电磁吸盘上，接通所述第一电磁吸盘的电源，使得磁珠在磁性作用下贴附在PCR管的管底，用移液枪吸走液体；加入所述洗涤液，在PCR管的顶部放置第二电磁吸盘，使得所述第一电磁吸盘和所述第二电磁吸盘的电源交替开关，从而使得浸泡在所述洗涤液中的磁珠在PCR管的底部和顶部来回运动达到洗涤的目的；最后关掉所述第二电磁吸盘的电源，打开所述第一电磁吸盘的电源，静置后，用移液枪吸走液体；所述洗涤液是无RNase的水；

所述甲型流感病毒亚型分型检测方法不用于疾病诊断或治疗。

2.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测方法，其特征在于，H1N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记、H5N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记和H7N9亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记分别是CY5、VIC和FAM；或者H1N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记、H5N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记和H7N9亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记分别是VIC、FAM和CY5；或者H1N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记、H5N1亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记和H7N9亚型5’端带荧光标记的反向引物的荧光标记分别是FAM、CY5和VIC。