[发明专利]一种整合型酵母重组表达系统及使用方法

说明书

一种整合型酵母重组表达系统及使用方法，该酵母为URA3基因缺陷型，并含表达URA3基因且整合到酵母基因组的载体。该方法目的在于构建得到URA3基因改造的基因缺陷型贝酵母菌株作为遗传转换的筛选标记，同时也为PYIP5的转化提供可以用于整合遗传的整合位点。改变了目前酵母表达中普遍遇到的附加型整合方式带来的遗传传代不稳定，以及导致高密度发酵的时候质粒丢失产生不表达的现象。该表达系统适用于多种酵母。经过验证该酵母整合方式传代300代均能稳定遗传，且高密度发酵中可以节省90％的培养基成本。

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达领域，具体涉及一种整合型酵母重组表达系统及使用方法。

背景技术

酵母是低等的单细胞真核模式生物，已完成基因组测序，遗传背景清晰，具有生长繁殖快，成本低，易于实现高密度培养和大规模发酵的优点。目前发展成熟的酵母表达系统主要包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。

毕赤酵母表达系统具有操作简便、遗传稳定、表达量高、对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰功能，使表达的重组蛋白具有同天然蛋白相似的生物学功能，在非糖活性蛋白生产上具有显著优势。虽然酿酒酵母表达相对于原核生物表达具有一系列可以保证蛋白活性的翻译后修饰，但是酿酒酵母相对于毕赤酵母表达依然存在一些缺陷。最明显的缺陷便是目前的酿酒酵母多采用附加型转化的方式。比如常见的PYES2载体搭配INVSC1的宿主以及PEGH载体搭配Y258宿主都是采用这样的遗传转化方式。而目前主流的毕赤酵母遗传转化方式为整合型转化方式。通常需要把环形的质粒进行线性化酶切之后整合到毕赤酵母的基因组上。整合型的遗传转化方式外源基因的复制扩增可以随着酵母的基因组基因的复制扩增而扩增，且传代比较稳定，在不含有外界筛选压力的情况下外源基因不会被丢失。

本申请提供了一种整合型酵母重组表达系统及使用方法，目的在于改变目前酵母表达中普遍遇到的附加型整合方式带来的遗传传代不稳定，以及导致高密度发酵的时候质粒丢失产生不表达的现象。本申请的酵母表达系统构建得到URA3基因改造的基因缺陷型贝酵母菌株作为遗传转换的筛选标记，同时也为PYIP5的转化提供可以用于整合遗传的整合位点。该表达系统适用于多种酵母。经过验证该酵母整合方式传代300代均能稳定遗传，且高密度发酵中可以节省90％的培养基成本。

发明内容

本发明目的在于改变目前酵母表达中普遍遇到的附加型整合方式带来的遗传传代不稳定，以及导致高密度发酵的时候质粒丢失产生不表达的现象，提供一种整合型酵母重组表达系统及使用方法。

首先，本申请提供了一种整合型酵母，该酵母为URA3基因缺陷型，并含表达URA3基因且整合到酵母基因组的载体。所述URA3基因缺陷可以是URA3基因全长或部分缺失或敲除。所述缺失或敲除可以通过同源置换实现。所述载体可以是整合型质粒载体。所述载体可以是表达URA3基因的载体。所述整合型质粒载体可以pYIP5。所述酵母可以是酿酒酵母或贝酵母。该酵母还含有能够稳定遗传的外源基因。进一步地，该基因可以是PGC3。

本申请还提供了一种整合型酵母表达系统，该表达系统包括整合型酵母，该酵母为URA3基因缺陷型，并含表达URA3基因且整合到酵母基因组的载体。所述URA3基因缺陷可以是URA3基因全长或部分缺失或敲除。所述缺失或敲除可以通过同源置换实现。所述载体可以是整合型质粒载体。所述载体可以是表达URA3基因的载体。所述整合型质粒载体可以pYIP5。所述酵母可以是酿酒酵母或贝酵母。该酵母还含有能够稳定遗传的外源基因。进一步地，该基因可以是PGC3。

本申请还提供了一种构建酵母及酵母表达系统的方法，其特征在于构建URA3基因缺陷型酵母，将含有URA3基因及外源基因的载体线性化后整合至酵母基因组。所述URA3基因缺陷可以是URA3基因全长或部分缺失或敲除。所述缺失或敲除可以通过同源置换实现。所述载体可以是整合型质粒载体。所述载体可以是表达URA3基因的载体。所述整合型质粒载体可以pYIP5。所述酵母可以是酿酒酵母或贝酵母。该酵母还含有能够稳定遗传的外源基因。进一步地，该基因可以是PGC3。