[发明专利]一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法

说明书

本发明公开了一种淫羊藿ISSR‑PCR分子标记方法，采用引物及ISSR‑PCR反应体系对提取的淫羊藿嫩叶的DNA样品进行扩增即可完成。本发明利用引物及优化后的ISSR‑PCR反应体系对淫羊藿的DNA进行ISSR‑PCR扩增，该方法准确可靠、操作简单、节约时间和成本，扩增条带清晰稳定，多态性好，对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定及良种选育等方面具有较好的应用价值。

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法。

背景技术

淫羊藿属(Epimedium L.)植物是小檗科(Berberidaceae)多年生草本药用植物，具有补肾强身，强筋健骨、祛风湿等功效，是我国传统中药材之一。我国是淫羊藿最主要的分布区，淫羊藿属植物约占世界总数的80％，在甘肃、贵州、湖南、湖北等地均有分布。研究表明，不同产地淫羊藿的活性成分、形态、质量差异较大，且不同居群的淫羊藿生物学特征也存在明显差异，这表明淫羊藿资源生物多样性丰富。目前。关于淫羊藿的研究主要集中在其活性成分、分类、抗逆性、光合生理、物候特征等方面，而缺乏关于其遗传变异的研究。

分子标记技术能从DNA水平上反映物种的遗传差异，是研究遗传多样性的有效方法。近年来，ISSR分子标记技术因其操作简单、多态性高、重复性好等优点被广泛应用于动植物的品种鉴定等。但ISSR标记是一种随机性标记方法，不同物种甚至同一物种不同条件下其试验参数均有差异，因此建立一个科学合理的ISSR-PCR反应体系，探寻最佳的PCR各组分的用量，可为后续开展淫羊藿的遗传多样性研究及良种选育等工作提供理论依据。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有针对淫羊藿的研究缺乏关于其遗传变异研究的问题，提供了一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法，具体包括以下步骤：

步骤1，采集淫羊藿的嫩叶，提取植物组DNA；

步骤2，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；

步骤3，采用引物及ISSR-PCR反应体系对步骤1提取的DNA样品进行扩增。

进一步地，步骤3中ISSR-PCR反应体系为：20μL的反应体系中含有2×Taq MasterMix 9.8μL，模板DNA 30ng，引物0.325μM。

进一步地，步骤3中ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，46.8～65℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。

进一步地，步骤3中引物为：

UBC808，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1；

或UBC814，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.2；

或UBC826，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.3；

或UBC827，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.4；

或UBC840，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.5；

或UBC846，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.6；

或UBC856，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.7。

进一步地，步骤3中引物在ISSR-PCR扩增中优化后的退火温度，具体如下：UBC80860.3℃；UBC814 46.8℃；UBC826 60.3℃；UBC827 65℃；UBC840 52.4℃；UBC846 54.3℃；UBC856 54.3℃。