[发明专利]用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物、检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供用于检测人胃肠道间质瘤C‑KIT基因V559A突变的引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的检测引物能与C‑KIT基因的特异序列结合，扩增突变序列。本发明提供的检测方法采用检测荧光信号基团与扩增片段结合发出荧光信号，利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术，建立基于实时荧光PCR的试剂盒，可准确检测C‑KIT基因V559A突变。本发明方法操作简单，结果易读；灵敏度高，能检出含0.001％C‑KIT基因V559A突变的样本，实现对C‑KIT基因V559A突变的超灵敏检测。

本申请要求了2017年09月08日提交中国专利局的，申请号为201710806478.7，发明名称为“用于超灵敏检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因突变的引物、检测方法及试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A 突变的引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

C-KIT是一种原癌基因，位于染色体4q11-12，大小约80kb，编码145KD的跨膜蛋白CD117，属于第Ⅲ类酪氨酸激酶受体家族，具有胞外配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区。

胃肠道间质瘤(gastro in testina l stromal tumor，GIST)是消化道最常见的间叶性肿瘤，也是肿瘤生物靶向治疗中的典范。胃肠道间质瘤起源于胃肠道卡哈尔间质细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)或向ICC分化的原始间充质细胞。

绝大多数GIST表达C-KIT编码的KIT蛋白(CD117)，且在许多病例中存在C-KIT基因突变，由此通过相互独立地获得传导性激活。即在无配体结合的情况下，KIT仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号传导通路。C-KIT原癌基因表达产物C-KIT受体与其配体细胞因子结合后，可激发酪氨酸残基磷酸化，从而调节细胞的生长，对肿瘤的增殖、恶性演进及凋亡等方面都有重要作用。胃肠间质瘤的C-KIT突变区主要集中在4个外显子：9、11、13、17，最常见的为11外显子突变，约占65％。

目前研究表明，原癌基因C-KIT不仅参与了ICC分化发育及GIST的发生发展，而且C-KIT基因突变还与GIST危险度、基因靶向药物耐药性及预后有关，伊马替尼(Imatin ibmesy late ST I-571)或称为格列卫(G leevec)作为一种KIT酪氨酸激酶抑制剂，已应用于转移性和手术难于切除病例的治疗以及部分高度侵袭危险性病例的术后预防性化疗。

由于患者基因背景的不同，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在个体差异。因此，对药物作用相关基因的检测，可指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。

目前C-KIT基因突变检测的方法很多，如测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，高效液相色谱法，荧光定量PCR法等。其中最常见方法还是测序法，该法费用较高，操作耗时长。若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗。另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常DNA背景下检测极其微量的异常DNA 分子的要求。因此，如何快速准确的检测C-KIT基因突变，就成为人们亟待解决的问题。

发明内容