[发明专利]一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法

说明书

本发明公开了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，该方法主要包括以下步骤：孔板修饰与人多能干细胞(hPSC)接种培养、细胞消化并接种于三维基质中、人羊膜腔发育模型的建立等步骤，本发明利用hPSC的自组装性质在三维基质材料中形成了具有近生理的三维空腔结构，这些空腔也具有了羊膜腔早期、中期功能的表达特点。该方法具有简单易操作、诱导效率高、重复性强等特点。该模型的建立可为探索人类羊膜发生在细胞水平和分子机制研究领域提供平台，在羊膜腔的形成与发育过程中的表观遗传学的研究中也具有极大的应用价值。

技术领域

本发明涉及胚胎发育学，组织仿生以及细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法。

背景技术

上皮腔的形成，如囊肿和小管，是许多组织和器官正常发育的必要过程，包括内脏、肝脏、肾脏、血管、肺。在人胚胎发生过程中多能上皮细胞会形成囊胚腔，植入后形成具有极化的鳞状上皮的羊膜腔。尽管具有基本和临床意义，但由于对早期人类胚胎的研究太少，以及人类与其他常用的动物和细胞模型在形态发生方面存在明显分歧，这种胚胎外组织在人类体内的发育仍是一个谜。目前，体外研究人类胚胎发生的工作取得了一些进展，但胚胎外组织(如羊膜上皮细胞)的发育仍不甚清楚。

人多能干细胞(hPSCs)已被诱导成与胚胎中的上皮细胞类似的多能状态，已成功应用于人类胚胎发育模型。研究表明，hPSCs具有在细胞外基质(ECM)内形成腔的内在生物学特性。一个多能干细胞球能够自我组装成极化的上皮细胞。由于在哺乳动物早期发育中腔的形成是不可缺少的，因此hPSCs可以提出一个简单而有用的模型来探索这一过程。然而，囊状结构可以维持时间较短，5天内会内迅速形成单层细胞结构。在整个过程中，hPSCs多能干性基因的表达在大多数研究中仍然保持，短期培养可能限制体外hiPSC囊肿的形态发生。

现有文章的报道，羊膜腔的发育是一个静态的过程，而这与体内三维物理微环境是不相符合的，即体内羊膜腔的发育是依赖于母体血浆和羊水，是一个动态的物理环境。所以说，在体外研究羊膜腔的发育是需要考虑到流体条件的。器官芯片作为细胞培养载体，不仅可以实现通道结构尺寸的灵活设计，而且能在三维环境中模拟细胞微环境的关键因素，包括流体流动、信息交互、生化信号等等。流体控制有助于促进营养物质和氧气的交换，减少细胞凋亡或细胞团中心坏死现象，为细胞培养提供良好的生存环境。结合微流控技术不仅能解决现有设备存在体系复杂和营养物质运输欠缺的问题，还可进行细胞的实时监测和观察。但是目前将微流控与羊膜腔发育相结合尚属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法。结合微流控灌流系统的优势通过三维细胞培养和流体控制等要素，模拟体内羊膜腔形成及发育的细胞微环境，不仅研究了3D基质中羊膜腔的发育情况，并实现长期培养，还保证了充分的营养物质和氧气的交换，并具有高通量、低成本、易操作、可原位示踪与监测的特点。这一方法构建的模型具有近生理的三维腔结构，包括极性与非极性羊膜腔结构。该模型可为探索人类羊膜发生和胚胎发生在细胞水平和分子机制研究中提供了一个技术支撑。

本发明提供了一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：器官芯片的制备、孔板修饰与人多能干细胞接种培养、羊膜腔在器官芯片中的发育。

所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口、左侧灌流通道、左侧培养液出口组成，右侧结构由右侧培养液入口、右侧灌流通道、右侧培养液出口组成，中间结构由灌3D基质入口和灌3D基质通道组成，其中灌3D基质通道由灌3D基质纵向通道和灌3D基质横向通道组成；

液体由左侧培养液入口进入后通过左侧灌流通道，再由左侧培养液出口流出，或者液体由右侧培养液入口进入后通过右侧灌流通道，再由右侧培养液出口流出，左侧灌流通道与右侧灌流通道通过灌3D基质横向通道相连通。