[发明专利]一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法

权利要求书

1.一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：采用了一种三维基质材料人工基底膜matrigel,该模型的构建方法的主要步骤为：

(1)器官芯片的制备；

(2)孔板修饰与人多能干细胞接种培养；

(3)羊膜腔在器官芯片中的发育；

所述的器官芯片主要由左侧结构、中间结构、右侧结构组成；左侧结构由左侧培养液入口(1)、左侧灌流通道(2)、左侧培养液出口(3)组成，右侧结构由右侧培养液入口(4)、右侧灌流通道(5)、右侧培养液出口(6)组成，中间结构由灌3D基质入口(7)和灌3D基质通道(8)组成，其中灌3D基质通道(8)由灌3D基质纵向通道(9)和灌3D基质横向通道(10)组成；

液体由左侧培养液入口(1)进入后通过左侧灌流通道(2)，再由左侧培养液出口(3)流出，或者液体由右侧培养液入口(4)进入后通过右侧灌流通道(5)，再由右侧培养液出口(6)流出，左侧灌流通道(2)与右侧灌流通道(5)通过灌3D基质横向通道(10)相连通；

所述器官芯片左侧灌流通道(2)和右侧灌流通道(5)宽度范围为500μm-5mm、高度范围为500μm-1.3mm，灌3D基质纵向通道(9)宽度范围为1mm-10mm、高度范围为500μm-1.3mm，灌3D基质横向通道(10)宽范围均为100μm-800μm，灌3D基质横向通道(10)间距范围为100μm-800μm，高度范围为500μm-1.3mm；

步骤(3)羊膜腔在器官芯片中的发育，具体步骤为：

(1)细胞消化并接种于三维基质中

待hPSC细胞生长为70％-90％后用消化液室温消化，用细胞刮板刮下细胞团，离心600r1-3min，将上清液体吸走，用mTeSR1培养基将matrigel稀释到一定比例后将细胞重悬得到合适的接种密度并接种，细胞悬液从器官芯片中间结构的灌3D基质入口(7)灌入，37°培养箱放置20-40min使悬有细胞的matrigel固化，之后仍为mTeSR1培养,静置培养1天；

(2)人羊膜腔发育模型的建立

接以上步骤，从第2天开始器官芯片施加灌流体系，将灌流管内填充mTeSR1培养基，灌流管管口分别插入左侧培养液入口(1)和右侧培养液入口(4)，液体从左侧培养液出口(3)和右侧培养液出口(6)流出，左右侧灌流体系的流速可以调节；细胞处在3D灌流培养条件下，培养基为mTeSR1培养基，模型建立若干天。

2.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：所述器官芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物。

3.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(1)器官芯片的制备，具体步骤为：器官芯片的制备采用传统的光刻技术，将形成的SU8模板用三甲基氯硅烷蒸汽修饰，60℃-95℃烘5-20min，以便SU8模板疏水尽量不粘附PDMS，之后用PDMS聚合物反模即形成带有结构的上层PDMS芯片，下层PDMS芯片不含任何结构；所述器官芯片层的上下两层分别经过氧气等离子体处理20-90s进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用。

4.按照权利要求1所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(2)孔板修饰与人多能干细胞接种培养，具体步骤为：先用人工基底膜修饰6孔板并放于4°冰箱4小时-7天，之后放入37°培养箱20-50min，用细胞消化液室温消化；用细胞刮板刮下细胞团，600r离心1-3min，细胞用含Y27632的mTeSR1培养基重悬使细胞为小团块后接种于已修饰好的6孔板，37°培养1-4h后将培养液更换为不含Y27632的mTeSR1培养基培养。

5.按照权利要求4所述的一种基于器官芯片的人羊膜腔发育模型建立方法，其特征在于：步骤(2)所述人工基底膜修饰6孔板具体为：将人工基底膜稀释500-1000倍，每孔1.5ml稀释液，放于4°冰箱4小时-7天。