[发明专利]人原代肝癌组织的体外模型的建立方法

说明书

本发明涉及一种人原代肝癌组织的体外模型研究的技术领域，尤指人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，主要包括：1）收集新鲜肝癌组织标本；2）将肝癌组织置于培养液中；3）低温运输并准备进一步处理；4）将取得的肝癌组织切成米粒大小；5）所述肝癌组织经含抗生素的PBS清洗，然后置于48孔板中；6）所述肝癌组织经冰冻包埋切片，进行原位末端标记法，检测组织凋亡情况；7）切片均在显微镜下取三个视野；8）统计各组平均光密度；9）进行统计分析；本发明利用人原代肝癌组织进行体外培养，建立了一种抗凋亡、去分化的模型，进行体外的无血清培养，无需消化、传代，制备程序比较方便快捷，保留原发肿瘤的异质性和空间结构；更能减少组织凋亡。

技术领域

本发明涉及一种人原代肝癌组织的体外模型研究的技术领域，尤指人原代肝癌组织的体外模型的建立方法。

背景技术

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，尽管近年来采用分子生物学技术研究肝癌的发生，但仍缺乏对肝癌发病机制的确切认识，随着人们对肝癌动物模型研究的不断深入，逐渐建立了自发型、诱发性、移植性及转基因动物肝癌模型，因为这些模型很好地模拟了人类肝癌，可以用于肝癌的生理、细胞和分子等发病机制方面的研究，也可用于肝癌治疗药物的筛选以及基因治疗的探索。

原发性肝癌是最常见的高度恶性肿瘤之一，易多发、转移或复发等，一直以来，以肿瘤细胞系为主的二维培养(Two-dimensional culture,2D)模型为研究肿瘤癌变、分子遗传、浸润转移、药物治疗等方面做出突出贡献，但经过体外筛选的稳定细胞株缺乏肿瘤异质性；细胞增殖过程可能出现不可逆转的改变，包括基因的突变和缺失、生长和侵袭能力的改变；连续传代的肿瘤细胞株适应了外界培养皿的环境，缺乏肿瘤微环境的作用，如非肿瘤细胞、细胞外基质、肿瘤微环境因子，因此建立保留原发肿瘤特性，能够客观反应肿瘤实际情况的体外模型对于肿瘤研究具有重要意义。

近年来发展的体外三维培养(Three-dimensional culture,3D)的类器官模型(Clevers H.et al.,2016,2018)则是利用各种生物支架材料，如基质胶、胶原、海藻盐、聚乳酸、聚乙醇酸等，模拟体内微环境，使原代细胞形成良好的空间分布和细胞间联系，为体外药物筛选(Broutier L et al.,2017)、肿瘤干细胞研究(Papapetrou E P et al.,2016)等提供新型工具，但是该模型制备较难，技术要求较高；相比于肿瘤细胞系及肿瘤原代细胞，原代组织块更多的保留原发肿瘤的异质性和空间结构，最新的一项利用原发性胶质母细胞瘤组织的体外三维培养(Hubert C G et al.,2016)，为非上皮源性肿瘤的组织块培养奠定基础。

然而，体外培养的另一个关键点是培养基的选择和优化；传统的细胞系培养通常需添加血清，为细胞生长提供所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，促进细胞贴壁、生长与分裂增殖；但血清的长期作用，会促进细胞不可逆的分化和表型的丧失(Jasmund I et al.,2007)，此外，血清中成分复杂，不利于肿瘤相关信号通路研究，且来源地广批次间差异大。

因此，以肿瘤细胞系为主的二维培养模型经过体外筛选的稳定细胞株缺乏肿瘤异质性和肿瘤微环境的作用，且在增殖过程可能出现不可逆转的改变，如基因的突变和缺失等，不能客观反应肿瘤实际情况；而近年来发展的体外三维培养的细胞类器官模型虽然是体外药物筛选、肿瘤干细胞研究等提供新型工具，但是该模型制备较难，技术要求较高。

参考文献：

Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China,2015.CA:ACancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115-132.