[发明专利]一种血脊髓屏障OGD/R损伤模型及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种血脊髓屏障（BSCB）氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤模型的构建方法和应用。我们通过transwell培养体系在上室培养脊髓来源的微血管内皮细胞和在底室培养脊髓来源的混合胶质细胞来构建体外BSCB模型。在transwell上室的微血管内皮细胞与transwell底室的混合胶质细胞通过分泌细胞因子而相互作用，形成具有良好屏障功能的分子膜。我们对构建的体外BSCB进行OGD/R损伤处理后能有效地模拟体内缺血/再灌注对BSCB所造成的损伤，能更直接、准确地了解BSCB缺血/再灌注损伤后其结构和功能的改变特征。该研究结果具有高度的参考价值，从而为临床研究BSCB提供了有效的基础依据。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种血脊髓屏障氧糖剥夺/复氧 (OGD/R)损伤模型及其构建方法和应用。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后往往会造成受损平面以下肢体和躯干严重的运动、感觉功能缺损，且这些神经功能缺损往往是不可逆的。SCI后的神经 功能缺损由原发性损伤和继发性损伤所造成，原发性损伤是指脊髓直接遭受机械 暴力所造成的损伤，而继发性损伤是原发性损伤后一系列“瀑布”式损伤激活的 自身破坏过程。血脊髓屏障(Blood Spinal Cord Barrier，BSCB)在SCI的病理生理 过程中扮演着重要的角色，其破坏在继发性损伤中起着重要作用。因此，如何保 护SCI后BSCB结构和功能的完整性是控制继发性损伤的关键环节。

研究表明，SCI后BSCB遭到破坏，血液中的白细胞侵入到神经组织，而这 些白细胞可产生大量基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及致炎 因子等多种物质。而MMPs及致炎因子不仅导致BSCB中的内皮细胞损伤，而 且可导致脊髓的胶质细胞(星形胶质细胞及小胶质细胞)过度活化，脊髓胶质细 胞活化后同样可大量分泌致炎因子、活性氧及MMPs等损伤因子，进一步损伤 BSCB中的内皮细胞，最终使非脊髓损伤区的BSCB和神经组织也遭到破坏。 因此，抑制这种脊髓继发性损伤的恶性循环作用(正反馈损伤)是重建SCI后 神经组织微环境稳态和干预SCI的重要策略。

由于原发性脊髓损伤直接破坏了脊髓组织并引起脊髓组织释放大量损伤性 介质而导致BSCB自我调节功能损害、渗透性增加，从而进一步导致脊髓肿胀压 迫局部血管，最终引发局部血流中断以及因缺血缺氧或血栓形成致脊髓局部细胞 损伤和梗死。而脊髓损伤后水肿消退时缺血脊髓组织恢复血液再灌注可进一步引 起了其继发性损伤，并导致了BSCB的结构和功能的进一步破坏。因此，缺血再 灌注损伤与脊髓损伤后的继发性损伤以及BSCB的破坏密切相关。发展与完善 BSCB体外缺血缺氧再灌注病理损伤模型可以有效模拟脊髓损伤后BSCB的病理 改变，能够为脊髓损伤研究提供强有力的支持。体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤 能有效地模拟体内缺血/再灌注对BSCB组成细胞所造成的损伤，在排除体内其 他干扰因素的条件下，能直接、准确地了解脊髓缺血/再灌注损伤后BSCB结构 和功能的改变。

现已知有多种体外BSCB模型，比如星形胶质细胞与内皮细胞共培养模型、 周细胞与内皮细胞共培养模型，还有多种原代细胞的衍生细胞株和替代肿瘤细 胞，如小鼠bend.3内皮细胞、大鼠C6胶质瘤细胞、小鼠N9小胶质细胞等。

其中，星形胶质细胞与内皮细胞共培养模型与BSCB生理结构存在较大差 异，该模型中胶质细胞只有星形胶质细胞，而小胶质细胞也参与BSCB结构的组 成，所以这种模型是有明显缺陷的。而周细胞与内皮细胞共培养模型同样是与 BSCB生理结构存在较大差异，完全无胶质细胞，不能有效模拟体内BSCB生理 结构和功能。尽管非原代培养的细胞增殖快，实验可重复性高，但其并不是BSCB 正常生理状态下的结构组成细胞，不能完全模拟血脊髓屏障的物理形态结构与功 能作用。另外，bend.3与N9细胞株反复传代培养后，可能会遗失某些分子标志， 甚至一些生物学特性也可能会改变。

由此可见，目前在BSCB研究领域中BSCB模型的构建需进一步完善，同 时更需要一种规范而实用的BSCB损伤模型以利于该领域的研究。